[发明专利]利用SNaPshot技术检测绵羊FecB基因多态性的方法

权利要求书

1.用于SNaPshot技术检测绵羊FecB基因型的引物组合，其特征在于，

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-TTCAGATGGTGAAACAGATTGG-3’

下游引物R：5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCATC-3’

延伸引物的核苷酸序列如下：

S1：5’-TTCCGAGAGACAGAAATATATC-3’。

2.含有权利要求1所述引物组合的用于SNaPshot技术检测绵羊FecB基因型的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、核酸外切酶I和碱性磷酸酶中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.利用SNaPshot技术检测绵羊FecB基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物F和R，进行PCR扩增反应；

3)用核酸外切酶I和碱性磷酸酶对PCR扩增产物进行纯化；

4)以纯化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述延伸引物进行延伸反应；

5)分析延伸产物，从而对绵羊FecB基因型进行判定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增反应使用的反应体系以15μL计为：100ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液1.5μL，1.5mmol/L MgCl₂1.5μL，200μmol/L dNTPs0.3μL，100pmol/μL上、下游引物各0.15μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，去离子水补齐至15μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃3min；95℃15s，56℃15s，72℃30s，35个循环；72℃3min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中对PCR扩增产物进行纯化，使用的反应体系以7μL计为：PCR扩增产物3μL，10U/μL酶ExoI 0.2μL，5U/μL酶FastAP 0.8μL，酶ExoI缓冲液0.7μL，去离子水补齐至7μL；

反应条件为：37℃15min，80℃15min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)中延伸反应使用的反应体系以6μL计为：纯化后的PCR扩增产物2μL，SNaPshotMix试剂1μL，100pmol/μL延伸引物0.1μL，去离子水补齐至6μL；

延伸反应条件为：96℃1min；96℃10s，52℃5s，60℃30s，30个循环。

9.根据权利要求5-8所述的方法，其特征在于，步骤5)中采用测序法分析延伸产物。

10.权利要求5-9任一项所述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。