[发明专利]一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法。

背景技术

糖尿病是一种伴随多种严重并发症的常见病，暂无治愈疗法。胰腺移植是治疗糖尿病的重要途径，但供体来源短缺和免疫排斥问题限制其广泛开展。胰岛β细胞是唯一负责转运、合成和释放胰岛素的细胞，胰岛素是体内唯一降低血糖的激素，对外周血糖水平起重要调节作用。

多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)一种具有自我复制能力且在一定条件下可以分化成多种靶向功能细胞的干细胞，多潜能干细胞的使用，已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。然而，尽管多潜能干细胞能够解决供体细胞数量问题，但是在应用前还需要先将其诱导分化为功能性的胰岛素分泌细胞。近年来，国内外研究中将iPSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞的方法主要是利用基因工程技术将胰岛β细胞发育过程中重要的转录调控因子导入细胞内或直接导入活体器官组织，使iPSCs转分化为胰岛素分泌细胞。

如何有效地选择合适的小分子化合物或培养基，从而高效实现iPSCs定向诱导分化为胰岛β样细胞，是研究iPSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞的重要课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，旨在解决如何通过选择合适的小分子化合物或培养基，高效实现将iPSCs定向诱导分化为胰岛β样细胞的问题。

本发明是这样实现的，一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，包括以下步骤，

提供iPSCs，并使用培养基A进行培养；

待所述iPSCs生长至90％以上融合时，使用collagenase IV进行消化处理，分离成iPSCs小团块细胞；

将所述iPSCs小团块细胞接种于铺有MATRIGEL MATRIX的培养基上培养，待细胞生长至55-65％融合时，将所述细胞在培养基B中进行培养，得到细胞B，其中，所述培养基B为含有0.18-0.22％的BSA、0.45-0.55×N2、0.45-0.55×B27、95-105ng/mL activin A和0.08-0.12μM wortmannin的DMEM/F12培养基；

将所述细胞B在培养基C中进行培养，得到细胞C；

将所述细胞C在培养基D中进行培养，得到细胞D；

将所述细胞D在培养基E中进行培养，得到胰岛β细胞。

本发明提供的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，通过选择多种特定的培养基按照特定的顺序进行细胞培养，可以高效定向诱导iPSCs分化为胰岛β细胞，其转分化效率可达25％。此外，本发明提供的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，只需要在选定合适的培养基和培养顺序的基础上，有序地对细胞进行培养，操作简单可控，易于实现产业化。

附图说明

图1是本发明实施例提供的人皮肤来源的iPSCs诱导分化前细胞形态图；

图2是本发明实施例提供的人皮肤来源的iPSCs诱导分化4d的细胞形态图；

图3是本发明实施例提供的人皮肤来源的iPSCs诱导分化8d的细胞形态图；

图4是本发明实施例提供的人皮肤来源的iPSCs诱导分化13d的细胞形态图；

图5是本发明实施例提供的人皮肤来源的iPSCs诱导分化20d的细胞形态图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，包括以下步骤，

S01.提供iPSCs，并使用培养基A进行培养；

S02.待所述iPSCs生长至90％以上融合时，使用collagenase IV进行消化处理，分离成iPSCs小团块细胞；

S03.将所述iPSCs小团块细胞接种于铺有MATRIGEL MATRIX的培养基上培养，待细胞生长至55-65％融合时，将所述细胞在培养基B中进行培养，得到细胞B，其中，所述培养基B为含有0.18-0.22％的BSA、0.45-0.55×N2、0.45-0.55×B27、95-105ng/mL activin A和0.08-0.12μM wortmannin的DMEM/F12培养基；

S04.将所述细胞B在培养基C中进行培养，得到细胞C；