[发明专利]一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，包括以下步骤，

提供iPSCs，并使用培养基A进行培养；

待所述iPSCs生长至90％以上融合时，使用collagenase IV进行消化处理，分离成iPSCs小团块细胞；

将所述iPSCs小团块细胞接种于铺有MATRIGEL MATRIX的培养基上培养，待细胞生长至55-65％融合时，将所述细胞在培养基B中进行培养，得到细胞B，其中，所述培养基B为含有0.18-0.22％的BSA、0.45-0.55×N2、0.45-0.55×B27、95-105ng/mL activin A和0.08-0.12μM wortmannin的DMEM/F12培养基；

将所述细胞B在培养基C中进行培养，得到细胞C；

将所述细胞C在培养基D中进行培养，得到细胞D；

将所述细胞D在培养基E中进行培养，得到胰岛β细胞。

2.如权利要求1所述的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述iPSCs为人皮肤来源的iPSCs。

3.如权利要求1所述的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述培养基A为铺有Matrigel Matrix的人ES细胞无饲养层完全培养基。

4.如权利要求1-3任一所述的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述培养基C为含有0.45-0.55％的BSA、0.45-0.55％的ITS、0.45-0.55×B27、1.8-2.2μM RA、18-22ng/ml FGF7和45-55ng/mL NOGGIN的F12/IMDM培养基。

5.如权利要求1-3任一所述的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述培养基D为含有0.45-0.55％的BSA、0.8-1.2％的ITS、0.8-1.2×N2和45-55ng/mL EGF的高糖DMEM培养基。

6.如权利要求1-3任一所述的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述培养基E为含有0.8-1.2％的ITS、8-12ng/mL bFGF、8-12mMnicotinamide、45-55ng/mL Exendin-4和8-12ng/mL BMP4的DF12培养基。

7.如权利要求1-3任一所述的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述使用collagenase IV进行消化处理的步骤中，所述消化处理的温度为35-40℃，所述collagenase IV的浓度为180-220U/mL，消化时间为3-5min。

8.如权利要求1-3任一所述的诱导iPSCs分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤，

提供人皮肤来源的iPSCs，并使用铺有Matrigel Matrix的人ES细胞无饲养层完全培养基进行培养；

待所述人皮肤来源的iPSCs生长至90％以上融合时，用浓度为200U/mL的collagenase IV在37℃下进行消化处理，消化4min，所述iPSCs分离成iPSCs小团块细胞；

将所述iPSCs小团块细胞接种于铺有MATRIGEL MATRIX的培养基上培养，待细胞生长至60％融合时，将所述细胞在含0.2％BSA、0.5×N2、0.5×B27、100ng/mL activin A和1μM wortmannin的DMEM/F12培养基中进行培养，得到细胞B；

将所述细胞B在含0.5％BSA、0.5％ITS、0.5×B27、2μM RA、20ng/ml FGF7和50ng/mL NOGGIN的F12/IMDM培养基中进行培养，得到细胞C；

将所述细胞C在含0.5％BSA、1％ITS、1×N2和50ng/mL EGF的高糖DMEM培养基中进行培养，得到细胞D；

将所述细胞D在含1％ITS、10ng/mL bFGF、10mM nicotinamide、50ng/mL Exendin-4和10ng/mL BMP4的DF12培养基中进行培养，得到胰岛β细胞。