[发明专利]一种小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于动物组织蛋白提取领域，具体涉及一种小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法。

背景技术

TRPV3蛋白是一类表达于细胞膜上的非选择性阳离子通道蛋白，它能被温度及化合物2-APB，camphor等激活。它在大脑、肺部、肝脏和皮肤组织中都有广泛的表达，尤其是在皮肤组织角质形成细胞中的表达量比较高，它参与了皮肤角质屏障的形成，皮肤温度的感知，皮肤炎症的发生及导致罕见皮肤病Olmsted syndrome等，因此使得皮肤角质形成细胞TRPV3蛋白的研究成为了热门。在一些病理生理条件下，TRPV3在皮肤组织中的蛋白表达量会发生上调或者下调的变化，要检测这个表达量变化的幅度就得提取皮肤中TRPV3蛋白进行western blot量化分析。目前提取皮肤组织TRPV3蛋白使用得最多的是成年小鼠皮肤，它的常规提取过程简单描述为：处死成年小鼠；拔净毛发，用手术剪将小鼠背部皮肤剪下一小块，称量重量，放入EP管中；用手术剪子将皮肤块剪碎；往EP管中加入组织裂解液(Mammalian Protein Extraction Reagent，Pierce)；用电动组织研磨器研磨皮肤组织；待皮肤组织被研磨成匀浆时用枪吹打均匀；置冰上一段时间待裂解液充分将组织裂解；离心取上清蛋白进行蛋白浓缩用于下一步实验分析。成年小鼠皮肤外表皮是一层坚韧的角质层，在提取蛋白的过程中，这层表皮很难被裂解液裂解，而往往要借助于电动组织研磨器，研磨的时间也需要比较长，即便如此，最后提取到的蛋白总量也很低，而要提取到合适的TRPV3蛋白就更难上加难，甚至最后检测时往往检测不到TRPV3蛋白，因为要裂解皮肤组织就需要加入大量的裂解液，这会导致TRPV3蛋白被严重稀释，因此需要进行额外的蛋白浓缩后才能进行下一步的western blot实验，此外由于皮肤组织中有很多蛋白质，浓缩后的蛋白总量中，TRPV3占总蛋白的总量还是比较少，跑蛋白胶的结果很难用于定量分析。因此，有效的提取TRPV3蛋白成为一个需要解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、能高效获取TRPV3蛋白的小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法。

本发明的小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法，其特征在于，将新生小鼠的皮肤组织用中性蛋白酶处理分离出外表皮，以该皮肤外表皮为材料提取TRPV3蛋白。

优选，所述的小鼠皮肤组织TRPV3蛋白的提取方法，具体步骤如下：

将出生1～2天的小鼠处死后，剪下其皮肤组织，清洗，将清洗后的皮肤组织按照外表皮在上的方式放置，加入质量分数2.5％的中性蛋白酶(dispase分散酶，购自Sigma公司)在4℃条件下浸润(浸润皮肤块即可，蛋白酶液不能覆盖皮肤块)10h，将皮肤外表皮从皮肤组织块上剥下，清洗后吸干残余液体，称量，将皮肤外表皮剪碎，按每50mg皮肤外表皮加入500μl裂解液(Mammalian Protein Extraction Reagent，购自Pierce公司)的量加入裂解液，研磨，混匀，裂解完全后，再离心收集的蛋白上清液即为含TRPV3蛋白的溶液。

所述的剪下其皮肤组织是剪下其背部的皮肤组织。

所述的清洗是用PBS溶液清洗2-5次。

所述的离心，其条件优选为4℃，12000rpm离心10min。

本发明独创性的使用了新生小鼠(出生1～2天的小鼠)的皮肤组织来提取TRPV3蛋白，由于TRPV3主要表达于皮肤角质形成细胞中，皮肤角质形成细胞主要存在于外表皮及毛囊中，不同于成年小鼠皮肤组织外表皮的坚韧，新生小鼠的外表皮还未形成坚韧的角质层，而是主要由角质形成细胞组成，很容易通过中性蛋白酶分离，将分离出来的新生小鼠皮肤外表皮用于提取TRPV3蛋白会很高效，提取的TRPV3蛋白量会比较高，而且操作过程比较简单，所用的中性蛋白酶量也比较少，相对于从成年小鼠皮肤提取蛋白来说，这个方法更加简单高效。

附图说明

图1是实施例1的蛋白质免疫印迹图，其中TRPV3蛋白约为90kDa，GAPDH蛋白约为30kDa；图2是实施例1的蛋白质相对定量图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中所用中性蛋白酶为dispase分散酶，购自Sigma公司；所用裂解液为Mammalian Protein Extraction Reagent，购自Pierce公司。

实施例1

1、将出生2天的小鼠用手术钳夹住脖子处死；