[发明专利]利用循环放大体系构建一种灵敏检测的通用方法

说明书

技术领域

本发明涉及高分子材料及其应用，更具体地，涉及一种由超支化触发式自降解聚合物与酶有机结合而构成的循环放大体系；并且将这种循环放大体系与酶联免疫吸附检测结合，达到更佳的检测效果。

背景技术

疾病的诊断和治疗通常都需要利用病变组织/部位相对于正常组织的微环境差异，如酸碱环境或氧化-还原环境变化、糖浓度升高或降低、(辅)酶或蛋白质缺失/过量表达等。然而，这些病变特征微环境信号的强度相对于正常组织而言差别比较微弱。因此，为了使诊断或治疗试剂能够对这些病变部位的信号产生响应，必须赋予其放大能力。在自然界中，生物体系通过一系列的信号转导和放大过程来完成对外界信号或刺激的探测、感知与响应；这些弱的原始刺激信号的化学放大是通过一系列相互耦合的精密多分子过程实现的。视觉的产生就是一个很好的例子，视网膜感光时，视紫质中的视黄基发生光致异构导致蛋白质的构型改变，从而触发一系列酶级联反应，激发神经响应；此过程同时伴随着细胞膜Ca²⁺离子通道打开，大量的Ca²⁺进入细胞激发神经从而产生视觉。对这些生物过程的模仿催生了很多设计精巧的多分子放大体系，如聚合酶链式反应(PCR)，酶联免疫吸附检测(ELISA)，以及基于其他策略的新体系。这些多分子放大体系的构建极大地推动了高灵敏度临床检测诊断的发展。

为了在单分子层次实现信号的化学放大，化学家们发展了触发式自降解聚合物(Self-Immolative Polymer,SIP)体系，这类聚合物能够在触发解离特定位点的保护基元后自发进行类似多米诺骨牌的串联解聚，同时释放小分子构筑基元。触发式自降解树枝状分子，线性触发式自降解聚合物，以及超支化触发式自降解聚合物是三类主要的触发式自降解聚合物。其中，超支化触发式自降解聚合物兼具触发式自降解聚合物信号放大的特性以 及超支化聚合物合成简单、容易后修饰和官能化两方面的双重优势。

除了超支化触发式自降解聚合物的内在化学放大，信号放大还可以通过结合特异性的酶联反应来进一步的放大信号，而这个酶联反应的作用是利用将触发式自降解聚合物释放的片段转化为能够刺激聚合物解聚的物质，从而达到放大的效果。由于超支化触发式自降解聚合物相比其它的触发式自降解聚合物具有更大的放大效果，因此由其组成的循环放大体系具有更佳的放大效果。综上所述，结合超支化触发式自降解聚合物与酶促反应构筑循环放大用于灵敏检测将非常有实用意义。

发明内容

本发明的目的是为了构建一种能够检测低浓度物质的循环放大试剂盒，并且使其能够检测较多的物质，特别使其具有临床上的检测意义。

具体的，本发明提供一种能够放大信号的循环放大检测试剂盒，所述试剂盒包括共价连接有荧光分子与酶底物的水溶性的超支化触发式自降解聚合物，和能够将所述酶底物转变为过氧化氢的酶，其中所述超支化触发式自降解聚合物能够在过氧化氢的刺激下释放多个荧光分子与多个酶底物。

在一个优选的实施方案中，所述共价连接有荧光分子与酶底物的超支化触发式自降解聚合物的结构如下：

其中表示酶底物，F表示荧光分子。

在一个优选的实施方案中，

或或

在一个优选的实施方案中，所述酶的种类与所述酶底物S相对应；其中，S1对应于胆碱氧化酶，S2对应于肌氨酸氧化酶，S3对应于葡萄糖氧化酶，S4对应醇氧化酶。

在一个优选的实施方案中，所述循环放大检测试剂盒还包括额外的超支化触发式自降解聚合物2，所述聚合物2共价连接有待分析物响应基元和酶底物，并且能够在待检测物的刺激下脱去响应基元，并释放酶底物。

在优选的实施方案中，所述共价连接有待分析物响应基元的超支化触发式自降解聚合物2的分子结构如下所示：

其中，AG为待分析物响应基元，为酶底物。

在一个优选的实施方案中，

或

在一个优选的实施方案中，所述循环放大检测试剂盒还包含额外的酶2，该酶2能够催化前底物分解成酶底物。

在一个优选的实施方案中，对于酶底物S1，酶2为乙酰胆碱酯酶，前底物为乙酰胆碱；对于底物S3，酶2为蔗糖酶或碱性磷酸酶，前底物为蔗糖或葡萄糖-6-磷酸。

在一个优选的实施方案中，所述循环放大检测试剂盒还包含酶标检测抗体和捕获抗体。