[发明专利]包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法。

背景技术

自10多年前RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术发现以来，RNAi已经成为细胞遗传的关键调节器和阐明机体生长、发病机制和衰老的有力工具。siRNA与相关的蛋白质结合成RNA。RISC通过siRNA的引导识别并降解靶基因的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，使特定蛋白的表达受到抑制，进而特异性导致基因沉默。RNAi成功的关键在于是否能将siRNA完整地转染入靶细胞，与靶基因mRNA结合，其中siRNA在体内的稳定性具有重要意义。研究表明：通过对siRNA结构进行化学修饰和对siRNA骨架进行载体修饰是提高siRNA体内传递稳定性的2个重要途径。

siRNA发挥作用时具有高度的序列特异性和很强的靶向性。RNAi具有级联放大效应，极少量的双链核糖核酸(double-stranded RNA，dsRNA)便可降解比自身浓度大得多的mRNA，，但体内注射siRNA后，复合物必须经过全身循环系统，尽可能避免肾脏肾小球的滤过，吞噬细胞的吞噬，血清蛋白吸附和内源性核酸酶的降解，以及网状内皮系统(RES)的滞留才能到达靶细胞。siRNA在血清中的稳定性较差，容易被核酸酶RNase降解。静脉注射siRNA后，siRNA通过血液循环分布到各大器官，同时经历消除。siRNA经血管进入组织间质(外渗)，然后横跨间质到达靶细胞，到达靶细胞后通过内吞摄取。在此过程中，siRNA被内涵体启动的内吞小囊泡包埋，必须从内涵体逃逸，释放到细胞质中，并加载至RISC方能发挥作用。siRNA的外渗和穿透能力取决于靶组织的物理结构，而它的胞内摄取量还与siRNA与载体的表面性质有关。将siRNA传递到靶部位的最大障碍是内涵体对siRNA和载体的包埋和溶酶体对siRNA和载体的降解。

裸siRNA自身带负电，分子量大，极性强，很难穿过细胞膜、血管内皮，容易在脾脏滞留，在生物体内容易被核酸酶降解，半衰期短，转染效率低，甚至会产生强烈的炎症反应等。因此，siRNA的体内稳定性对其疗效的发挥至关重要。利用各种载体的协助，将siRNA通过不同的手段高效地递送到靶细胞是当前研究的重点。

发明内容

本发明一个技术方案是提供一种包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，组合物包含siRNA序列和大环酯类化合物。

优选地，所述组合物还包含磷脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。

优选地，所述组合物中按照质量份数计算，所述的siRNA 1-5份和大环酯类化合物化合物2-5份。

优选地，所述组合物中所述的siRNA序列为HBV siRNA：

正义链:[mC]CG[mU]GUG[mC]ACUUCGCUU[mC]A[dT][dT]；

反义链:UGAAGCGAAGUG[mC]A[mC]ACGGUC。

优选地，所述组合物中，按照质量份数计算，所述的siRNA序列1-5份、大环酯类化合物化合物1-5份，磷脂0-3和脂质-聚乙二醇1-10。

优选地，所述组合物中，按照质量份数计算，所述的siRNA1份、大环酯类化合物化合物2份，磷脂0.5份和脂质-聚乙二醇3份。

优选地，所述组合物中，所述磷脂选自DPPE、DPPC、DPPG、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂，磷脂酰肌醇和心肌磷脂中的一种或几种；

所述脂质-聚乙二醇选自胆固醇-聚乙二醇、双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1,2-二亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨、双棕榈酰基甘油聚乙二醇和双硬脂基甘油聚乙二醇中的一种或几种。

所述T2C1化合物的结构式如下：

所述T2C1化合物是由1,4,7,10-四氮杂环十二烷和环氧化合物在90℃反应得到；反应时置于玻璃容器内，持续搅拌，反应摩尔比为1:4，反应时长为24-72小时，优选为28-65小时。环氧化合物优选环氧烷基缩水甘油醚(烷基C₁₂-C₁₄)。

优选地，所述T2C1化合物是称量1,4,7,10-四氮杂环十二烷与C12-14-烷基缩水甘油醚mg混合，然后在92℃搅拌下孵育43小时合成T2C1。

本发明另一个技术方案是提供包含大环酯类化合物和siRNA的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：