[发明专利]一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体CPB-LAR-GFP

说明书

技术领域

本发明涉及获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体CPB-LAR-GFP。

背景技术

红豆草(Onobrychis viciaefolia)为多年生草本植物，其地上部分粗蛋白质及氨基酸含量丰富，含有一定数量的粗脂肪、多种维生素和矿物质及其他化学物质。红豆草的种子产量和产草量高，结实性能较好，营养物质全面而丰富，适口性优良[陈宝书.中国草原,1983,(2):36-45.]。甘肃红豆草(Onobrychis viciifolia cv.Gansu)是由普通红豆草和高加索红豆草自由杂交多次混合授粉的植株中单株选择培育成的[陈宝书.红豆草[M].兰州:甘肃科学技术出版社,1992.]。选育目的是为我国干旱半干旱地区建立人工草地。其产草量接近或超过早熟、速生、抗病虫害、高产、耐旱的紫花苜蓿品种。

可溶性蛋白含量高是苜蓿引起家畜臌胀病的主要原因[Howarth R E,et al.Journal of Agricultural and Food Chemistry,1977,25(1):175-179.]。缩合单宁能够与可溶性蛋白质作用生成沉淀，避免引起臌胀病，然而紫花苜蓿叶片不含缩合单宁，只在种皮中少量存在。红豆草在各个生长时期叶片都能生产高浓度的缩合单宁[吴自立等.中国草地学报,1993,(5):25-27.]。家畜饲用有大分子缩合单宁的红豆草后不会患臌胀病，普遍认为红豆草是在遗传资源创新途径和饲草利用方式解决紫花苜蓿引起牲畜臌胀病发生的一种理想牧草[(1)McMahon L R,et al.Canadian Journal of Plant Science,2000,80:469–485；(2)王玉萍等.草地学报,2000,8(2):126-131.]。在遗传资源创新方向，从红豆草中鉴定和分离缩合单宁合成酶基因，进而利用基因工程技术将此基因导入到苜蓿中去，不失为一条改善苜蓿品质和适口性的有效途径。

缩合单宁合成途径主要由公共苯丙烷途径、核心类黄酮-花青素途径、缩合单宁特异途径完成，其中缩合单宁特异途径最终决定其积累[Xie DY,et al.Science,2003,299(5605):396-399.]。缩合单宁特异生成途径中有两个关键酶分别是无色花青素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)和花青素还原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)[(1)Xie DY,et al.Science,2003,299(5605):396-399；(2)Bogs J,et al.Plant Physiology,2005,139(2):652-663.]。LAR和ANR为单宁的生成提供了两条不同的途径和 不同的前体物质，然而前者的底物无色花青素又是经花青素合成酶合成的花青素成为后者的底物，LAR在缩合单宁特异合成途径中尤为重要[Yuan L,et al.Journal of Experiment Botany,2012,63(7):2513-2524.]。一些研究证实LAR基因的表达与缩合单宁的累积正相关[Paolocci F,et al.Plant physiology,2007,143(1):504-516.]。调控LAR基因的表达水平可以改变CT的积累。最早克隆的LAR基因来自豆科植物——金钱草(Desmodium uncinatum)，该基因编码的蛋白可催化产生儿茶素，证明了LAR为单宁合成途径中的限速酶[Tanner GJ,et al.Journal of Biology Chemistry,2003,278:31647-31656.]。在感染叶锈病的杂交杨(P.trichocarpa×P.Deltoides)中，单宁合成途径中关键酶基因LAR的转录水平明显增加，单宁含量显著升高[Miranda M,et al.Molecular Plant-Microbe Interactions,2007,20:816-831]。