[发明专利]一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体CPB-LAR-GFP

权利要求书

1.用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为具有绿色荧光蛋白GFP标记基因和抗除草剂bar基因的缩合单宁合成酶LAR基因植物表达载体CPB-LAR-GFP。

2.根据权利要求1所述的用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）红豆草无色花青素还原酶LAR基因的克隆：

选择甘肃红豆草叶片提取RNA并纯化RNA，反转录合成cDNA第一链，PCR扩增LAR基因；将回收的扩增产物连接到T载体转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序；将测序结果进行比对分析；确定缩合单宁合成酶LAR基因，得到重组子为：pMD-LAR；

2）绿色荧光蛋白GFP基因的亚克隆：

挑取pBI121-Lyz-GFP菌株的单菌落，摇菌、提取质粒，PCR扩增GFP基因，将回收的GFP目的片段与T载体连接后转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序，得到重组子为：pMD-GFP；

3）CPB-LAR-GFP植物表达载体的构建及鉴定：

对pMD-GFP进行BamHⅠ和SmaⅠ双酶切，切下GFP基因；对pMD-LAR进行SmaⅠ和SacⅠ双酶切，切下LAR基因；对载体CPB进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切，通过T4 DNA连接酶将具有粘性末端的载体和基因，16℃过夜连接，连接产物转化感受态E.coli DH5α，挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，得到CPB-LAR-GFP植物表达载体。

3.获得一种转基因苜蓿的方法，是将权利要求1所述的CPB-LAR-GFP植物表达载体通过农杆菌介导法导入苜蓿中，得到具有抗除草剂性质和缩合单宁含量高的转基因苜蓿。

4.根据权利要求3所述的获得一种转基因苜蓿的方法，其特征在于，是采用冻融法将植物表达载体CPB-LAR-GFP转化至根癌农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂布于含卡那霉素、利福平和链霉素的YEB固体培养基上，28℃恒温培养2d，挑取阳性单菌落，进行PCR鉴定。

5.根据权利要求4所述的获得一种转基因苜蓿的方法，其特征在于，将重组农杆菌转化紫花苜蓿的具体操作包括以下步骤：

a）取含供试质粒CPB-LAR-GFP的农杆菌LBA4404，划线28℃培养2d后，挑取单菌落28℃振荡培养过夜，次日取500μL菌液至20 mL的YEB液体培养基中，28℃，摇菌至OD₆₀₀值为0.3～0.5的生长对数期，收集菌液，10000 r/min离心2min，弃上清，用MS液体培养基洗涤，10000r/min离心2min，再用MS液体培养基重悬菌体，即为侵染所用菌液，所述YEB液体培养基中含有50μg/mL 卡那霉素Kan、25μg/mL 链霉素Str和25μg/mL 利福平Rif；

b）剪取紫花苜蓿无菌苗的下胚轴，用步骤a）得到的活化农杆菌侵染10min，侵染完用无菌水将组织材料清洗干净，用无菌滤纸将水吸干，共培养3d后转入诱导培养基，暗培养25d后，转入分化培养基，待分化出苗后，再诱导生根、炼苗，进行后续分子检测和生理指标测定。