[发明专利]用于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物检测领域，尤其是涉及一种用于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用。

背景技术

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（DEHP）作为目前使用最普遍的塑化剂，是一种环境荷尔蒙，具有稳定性极强，难降解的特性。随着塑料制品的大量生产和使用，在造成环境“白色污染”的同时，DEHP也不断进入水域环境。包括DEHP污染物在内的大量的有机污染物通过各种途径进入海洋环境，并最终迁移至海洋生物体内或富集于底质和悬浮物中，对海洋环境和海洋生物造成极大的危害。DEHP对海洋生物的毒性作用主要包括富集及降解作用和水生生物遗传毒性作用、繁殖生长发育及免疫系统的影响。

双壳贝类一直是被国际上普遍接受的生物指示物。菲律宾蛤仔以其地理分布广、是沿海海区的优势种、生物体能累积污染物、能对多种环境污染物产生响应等特点被人们广泛的应用于污染物检测和预警研究中。蛤仔拥有开放式的循环系统，当受到环境胁迫时，血淋巴细胞参与细胞免疫发挥防御作用，是研究环境毒理的理想组织，可研究通过对DEHP胁迫下菲律宾蛤仔血细胞中免疫基因差异表达结果的筛查，得到了对DEHP响应灵敏的生物标记物。

对于海洋环境中的污染物有精度较高化学方法，但是在应对突发的污染事故仍不够高效，以基因芯片为载体，利用生物标记的生物监测方法具有快速、高效的特点，是理想的检测工具。生物监测不仅能够在一定程度上反应环境中污染物的水平，更能够反应污染物的生物效应，克服了化学方法的局限性，不需要仪器维护等工作，扩大了使用范围。但是，目前国内外还没有公开任何关于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、检测快速的用于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种用于检测环境污染物DEHP的基因芯片，包括点制在玻片上的探针，所述的探针包括探针1、探针2和探针3，所述的探针1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的探针2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针3核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

用于扩增探针1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；用于扩增探针2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；用于扩增探针3的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2、一种用于检测环境污染物DEHP的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

a、总RNA的提取：取蛤仔体腔液制备RNA提取液；

b、cDNA合成：取上述RNA提取液合成cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；

c、PCR扩增：50 μL扩增体系：10×Buffer 10.0 μL，dNTP mix 4.0 μL（终浓度200 μM），TqDNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，10 μM的正反向引物各1 μL，cDNA溶液1 μL（10~100 ng），ddH₂O补充至50.0 μL；扩增反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55~58 ℃ 45s，72 ℃ 45 s，35个循环；后延伸72 ℃ 10 min；

d、探针制备：将50 μL异丙醇加入到PCR扩增产物中混匀，-20 ℃放置30 min，4 ℃，12000 g离心5 min，取DNA沉淀，然后加入100 μL体积浓度为75%的乙醇水溶液洗一次，12000 g离心5 min，小心去掉上清，干燥，加10 μL无菌水溶解，得到探针溶液；

e、芯片制备：取5 μL探针溶液作为探针与5 μL点样液混合，有序的点印在预制好的玻片上，设计阳性对照、阴性对照并以点样液为空白对照，即得到用于检测环境污染物DEHP的基因芯片。

所述的探针溶液中包括包括探针1、探针2和探针3，所述的探针1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的探针2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针3核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的引物溶液中包括

用于扩增探针1的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：