[发明专利]一种用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定4型登革热病毒的方法。

背景技术

登革热病毒（Dengue virus，DENV）是一种黄病毒类RNA病毒，主要包括1～4型病毒（DENV 1～4）。登革热病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播，登革热病毒的感染可以引起登革热（dengue fever，DF），严重的还可导致登革出血热（Dengue hemorrhagic fever，DHF）或登革休克综合征（Dengue shocksyndrome，DSS）等。DENV广泛流行于全球的热带和亚热带地区，我国主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等省（自治区）。ENV-4型1979年从海南岛儋县北部白马镇开始沿西海岸向南北蔓延,波及堪江、佛山、广州、汕头、韶关等地区以及广西的北海、合浦,连续流行3年。

目前登革热病毒的鉴定方法主要为PCR，ELISA、免疫胶体金等方法。登革热检测常用的ELISA、免疫胶体金方法耗时长，通常需要5～7 d血清中才能达到抗体能够检测水平，同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应，出现假阳性率较高，故血清学检测作为登革热病毒检测局限性较大；DENV的分离可以很好的鉴定登革热病毒，但同样耗时长，敏感度又很低，也不可以作为早期检测登革热病毒的手段。近10 多年发展起来的DENV核酸检测技术，为登革热的早期诊断提供了可能，但PCR以及RT-PCR都需要昂贵的PCR仪作为基础，也在一定程度上限制了PCR方法在鉴定登革热病毒上的发展。

以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、灵敏度低、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速鉴定4型登革热病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于快速鉴定3型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒、以及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定4型登革热病毒的方法。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下组分：（1）用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）显色剂；（6）阳性对照和阴性对照；其中，所述用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组包括：

内引物1：5’- CGTTATTGGCGGAGCTACAGGGAGGCTATTGAAGTCAGGC-3’（SEQ ID No.1）；

内引物2：5’

-GTGGACTAGCGGTTAGAGGAGAGAGACTACAGCTTCATCTCAC-3’ （SEQ ID No.2）；

外引物1：5’- GCTCCTTTCGAGAGTGAAG -3’（SEQ ID No.3）；

外引物2：5’-GGTCTCCTCTAACCTCTAGTC-3’（SEQ ID No.4）；

环引物1：5’-CAGCACGGTTTGCTCAAG-3’（SEQ ID No.5）；

环引物2：5’- CCTTACAAATCGCAGCAACAA-3’（SEQ ID No.6）。

所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6～8：1：3～4。

所述逆转录酶为AMV逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

所述RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄溶液、5mM 甜菜碱，四者的体积比为6～8：4～5：2～3：8～10。

所述显示剂为SYBR GREENⅠ。

所述阳性对照为含有4型登革热病毒NS1基因片段（SEQ ID NO.7）的质粒，阴性对照为DEPC水。