[发明专利]一种用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒

权利要求书

1.一种用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下组分：（1）用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）显色剂；（6）阳性对照和阴性对照；其中，所述用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组包括：

内引物1：5’- CGTTATTGGCGGAGCTACAGGGAGGCTATTGAAGTCAGGC-3’（SEQ ID No.1）；

内引物2：5’

-GTGGACTAGCGGTTAGAGGAGAGAGACTACAGCTTCATCTCAC-3’ （SEQ ID No.2）；

外引物1：5’- GCTCCTTTCGAGAGTGAAG -3’（SEQ ID No.3）；

外引物2：5’-GGTCTCCTCTAACCTCTAGTC-3’（SEQ ID No.4）；

环引物1：5’-CAGCACGGTTTGCTCAAG-3’（SEQ ID No.5）；

环引物2：5’- CCTTACAAATCGCAGCAACAA-3’（SEQ ID No.6）。

2.根据权利要求1所述的用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6～8：1：3～4。

3.根据权利要求1所述的用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为AMV逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄溶液、5mM 甜菜碱，四者的体积比为6～8：4～5：2～3：8～10。

5.根据权利要求1所述的用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述显示剂为SYBR GREENⅠ。

6.根据权利要求1所述的用于快速鉴定4型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有4型登革热病毒NS1基因片段（SEQ ID NO.7）的质粒，阴性对照为DEPC水。

7.一种快速鉴定登革热病毒4型的方法，其特征在于，采用权利要求1～6任一项所述的试剂盒，加入模板RNA，在60～65℃，等温扩增60～90分钟，具体包括如下步骤：

（1）提取模板RNA；

（2）环介导等温基因扩增反应：25μl反应体系含有：内引物1、2各7～9pmol/μl，外引物1、2各1～2 pmol/μl，环引物1、2各3～5 pmol/μl，反应液 12～13μl，DNA聚合酶7～9U，待检RNA 1~100ng，逆转录酶1～2U，用灭菌去离子水补齐到25μl，然后加入18～22μl的密封液，将上述反应管于60~65℃反应60~90min；

（3）结果判断：在上述反应管中加入1-2μl显色剂10×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为登革热4型病毒，橙色则为非登革热4型病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，环介导等温基因扩增反应的25μl反应体系含有：内引物1、2各8pmol/μl，外引物1、2各1 pmol/μl，环引物1、2各4 pmol/μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶8U，待检RNA 1~100ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μl。