[发明专利]一种软骨素酶的大规模生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种软骨素酶的大规模生产方法。

背景技术

硫酸软骨素酶(chondroitinase,ChSase),是一类能将多种糖胺聚糖如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸等降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。该酶在研究机体内硫酸软骨素等糖胺多糖的功能和代谢方面、在治疗动脉粥样硬化、溶解椎间盘突出中破裂的纤维环或髓核、抗肿瘤、促进神经组织和神经轴的再生和增强软骨细胞与软骨的黏附力等方面有着广泛的应用前景。此外，低分子的硫酸软骨素具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特点，又由于硫酸软骨素在治疗风湿病、关节炎、骨质疏松症、腰椎间盘突出、治疗高血脂症、防治动脉粥样硬化和心绞痛、保存角膜及治疗角膜损伤等方面有显著的作用，已在食品、化妆品及保健品等行业进行应用。而酶解法制备低分子硫酸软骨素相对于目前广泛采用的酸水解法、离子交换法等具有不不需要特设复杂的实验设备、不污染环境等显著特点已成为应用和研究的趋势。虽然目前对软骨素酶有了一定的研究，但在国外，也就只有少数来自Proteus vulgaris和Flavobacterium heparinum的ChSase ABC、ChSase AC出售,但由于菌的产酶效率不高和其他问题，目前没有并未实现大规模生产，而且价格十分昂贵。在国内，目前除了少数基础研究，生产应用更是比较空白。因此目前急需一种高效、操作方便、生产周期短、适合大规模生产的方法来解决目前的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种软骨素酶的大规模生产方法，通过菌种的活化、逐级放大和在发酵罐中发酵获得软骨素酶，从而解决目前软骨素酶批量生产的空白。

本发明的方法根据菌体的对数期和稳定期生长情况和产酶情况的不同，对发酵条件进行分段实时调整，从而提高了软骨素酶的生产效率。

本发明的软骨素酶的大规模生产方法，包括如下的步骤：

1)菌种活化：

将食砜节杆菌CGMCC 1.3977菌种接种到种子培养基中，在28℃、150rpm的条件下振荡培养70h制成种子液；

其中种子培养基的组成如下：硫酸软骨素0.8％、MgSO4·7H200.8％、酵母浸粉0.6％、KH2PO40.02％、起始pH调整为6；

2)种子罐发酵：

将步骤1)制备的种子培养液按照体积比1.5％～2.5％的比例接种到20L种子罐的发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为25～30℃，优选为27～29℃，溶氧20％～60％，优选控制在40％～50％，搅拌转速为100rpm～150rpm，优选100rpm～125rpm；通气量开始为1～4L/min，优选2～3L/min，随着溶氧降低到临近20％～60％时，以1L/min的梯度适时调整；

发酵培养液的装液量为发酵罐容积的50％～70％，优选为60％～65％。

发酵培养液的组成为硫酸软骨素0.8％、MgSO4·7H200.8％、酵母浸粉0.6％、KH2PO40.02％、起始pH调整为6。

3)生产罐发酵：

在种子罐发酵的8～16h内，按照体积比1.5％～2.5％的比例接种到500L生产罐的发酵培养基中进行发酵培养，发酵罐的装液量为50％～70％，优选为60％～65％；

在发酵开始至发酵的4～14h内发酵温度为25～30℃，优选27～29℃，4～13h至发酵结束，发酵体系温度调低为25～27℃，优选为26～27℃；

在发酵开始后的前4～12h，溶氧控制在20％～60％，优选控制在40％～50％。其中相关参数搅拌转速为100rpm～150rpm，优选100rpm～125rpm，通气量开始为25～50L/min，优选30～40L/min随着溶氧降低到临近20％～60％时，以10L/min的梯度适时调整。

在发酵开始后的4～12h至发酵结束，溶氧控制在5％～30％，优选10％～20％，搅拌不变，通气适时调整。

在发酵开始后的4～14h至发酵结束要进行补料，补料起始时间在发酵温度降低调节后的1～4h，优选2～3h开始，补料时间不能提前，提前补料对产酶有很大影响。补料方法为：

以补料培养基中的软骨素浓度计算，将培养基配制浓度为25％的溶液，按补料液与发酵体系的体积比为1：100～1:300向所述的发酵体系中添加补料液。

补料的方式为定时补料，每隔2h添加补料培养基一次，直至发酵结束。

补料培养基的组成为：硫酸软骨素钠90％～100％，酵母浸粉0～10％。