[发明专利]一种大豆抗原β-conglycinin的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品及饲料安全检测领域，具体涉及一种大豆抗原β-conglycinin的检测方法。

背景技术

大豆中含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸，是人和畜禽优质的植物性蛋白源。但其中含有的抗原蛋白导致人和动物的过敏反应的现象越来越受到人们的关注。

大豆抗原是指能大豆中引起人及幼龄动物发生过敏反应的一类蛋白，其中β-conglycinin是主要的大豆抗原蛋白之一，使得大豆抗原蛋在食品及饲料行业中的广泛应用得到了阻畜禽生产中由于摄入含有大豆的日粮后能够引起仔猪和犊牛等幼龄动物呈现腹泻、生长受阻、肠粘膜细胞增生等过敏反应的现象普遍存在碍。因而寻求准确、简单、陈本低，快速检测大豆抗原蛋白的方法对于评价食品及饲料安全性有着重要的现实意义。

目前，检测大豆抗原蛋白的方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹、聚合酶链式反应(PCR)及高效液相色谱法。高效液相色谱法在使用上比较消耗时间并且仪器相对昂贵，不适合实际生产中的应用；蛋白质免疫印迹的检测手段具备一定的准确性，但是在试验的过程中需要消耗的时间比较长，并且试验成本比较大，因此在一些常规的生产检测中受到了限制；PCR技(Polymerase Chain Reaction)，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，但在后期在使用DNA含量、质量和提取量等等技术过程中都会使PCR技术受到影响，PCR检测过程中，任何影响DNA含量、质量和提取量的因素均会影响PCR技术的使用，因此就阻碍了此项技术发展和推广。

以上方法均具有一定的高效性和敏感性，但费用高，耗时长，不 适于生产中大量样品的快速分析。酶联免疫吸附试验，可进行定性或定量分析，具备操作简单、快速、适于批量检测等优点已得到了广泛的认可，目前常见检测方法有双抗夹心法和竞争法，但这些方法需要较多的蛋白标准品及其抗体，检测成本较高，其中间接竞争夹心ELISA方法由于步骤较繁琐，且浪费抗原试剂，故不适合于食品及饲料行业的大批量检测。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供一种大豆抗原β-conglycinin的直接ELISA检测方法，本发明检测方法具有样品前处理相对简单、快速、成本低、仪器化程度低、耗时短等特点，可应用于大豆及其深加工产品中大豆球蛋白含量的检测，适用于现场监控和大量样本筛查。

(二)技术方案

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来是实现:

一种大豆抗原β-conglycinin的检测方法，所述检测方法为直接ELISA检测方法，步骤为：

1)包被样品：用包被缓冲液稀释成浓度为20ng/ml～640ng/ml的β-conglycinin，同时做空白孔和阴性对照孔，在底板的反应孔中加100μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤ELISA反应板3-5次，每次3min～5min；

2)封闭：每孔加入封闭液于37℃封闭1h，同上洗涤三次；

3)加样：加入不同浓度的β-conglycinin多克隆抗体与相应的抗原结合，每孔100μl，置37℃孵育1h，然后洗涤；

4)加酶标二抗：将酶标二抗用抗体稀释液稀释5000倍，取100μl加入不同反应孔中，37℃孵育1h，洗涤；

5)加底物液显色：于各反应孔中加入配制好的TMB底物溶液100 μl，37℃反应15min～25min；

6)终止反应：加2M硫酸，每孔50ul，终止ELISA显色反应； 

7)读取OD值：在酶标仪上，于492nm处，测各孔OD值，以阳性对照约为1.0，阴照小于0.1，且阳性/阴性(P/N)≥2的条件作最适条件，据此选择包被抗原和一抗体的工作浓度。

一种大豆抗原β-conglycinin的检测方法，所述直接ELISA检测方法是将大豆抗原β-conglycinin兔多克隆抗体作为一抗，将羊抗兔作为酶标二抗，将TMB作为底物进行直接ELISA检测法，以定量检测大豆溶液中β-conglycinin的含量。