[发明专利]一种Decoy核酸阳离子脂质体载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种Decoy核酸阳离子脂质体载体及其制备方法。

背景技术

脂质体是由磷脂双分子定向排列而成的直径几纳米至几微米的超细粒子，双分子层内外分别包封脂溶性和水溶性药物。脂质体具有能使药物具有靶向性、提高和延长疗效、缓和毒性、避免耐药性和改变给药途径等特点。自20世纪60年代Rahman等人首次将脂质体作为药物载体应用以来，关于脂质体的制备工艺，作用机制，体内分布，药理毒理等特性研究不断深入。

脂质体按照所带电荷特性可分为中性脂质体、正电性脂质体和负电性脂质体。由于脂质体具有类似生物膜的结构，安全性高，而且可以长时间吸附在靶细胞周围，促进药物的渗透与吸收，并可能经融合作用进入细胞内后再释放药物，同时可以较为容易的连接特异性配体而获得主动靶向性效果，因此脂质体作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方面极具潜力，具有能增加与癌细胞的亲和力，克服耐药性，增加癌细胞对药物的摄取量，减少用药剂量，提高疗效，较少毒副作用的特点。现有的针对脂质体的研究主要停留在如何利用脂质体将目标物运输到细胞内，在提高脂质体稳定性和包封率的同时，降低细胞毒性。

入核困难是长期以来困扰Decoy核酸药物的技术问题。Decoy核酸药物能够以转录因子为靶点从转录水平上调控基因表达，是一种靶向性强的新型药物，其主要存在问题是由于decoy药物所作用的靶位点转录因子多存在于细胞核内，因此需要药物输送系统携带药物穿透细胞膜与细胞核。现有技术中关于协助药物进入细胞核的脂质体还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种Decoy核酸阳离子脂质体载体，以提高转染细胞时的入膜率和入核率。

本发明还要提供上述Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，它包括如下步骤：

(1)将DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)和DOTAP((2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺)按质量比4∶1～1∶4混合，加入有机溶剂溶解得到混合溶液；

(2)将步骤(1)得到的混合溶液完全蒸干有机溶剂，使用HEPES缓冲液溶解剩余的固体部分，水合30～60min，水合结束后超声30～60min；

(3)将步骤(2)处理后得到的混合体系先过0.4～0.8μm的膜，再过0.03～0.2μm的膜，制备粒径小分布均匀的空白脂质体；

(4)将空白脂质体与鱼精蛋白、Decoy核酸按照质量比(50～120)∶(10～20)∶1混合，2℃～8℃孵育12～24h形成完整的Decoy核酸阳离子脂质体载体。

步骤(1)中，所述的有机溶剂为三氯甲烷。

步骤(1)中，每毫克二油酰磷脂酰乙醇胺和(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺的混合物中加入10ml有机溶剂。

步骤(2)中，蒸干有机溶剂的方法是使用旋转蒸发器蒸干。

优选地，步骤(2)中，所述的HEPES缓冲液为3～5mol/L pH 7.4的HEPES缓冲液。

优选地，步骤(2)中，水合温度为20℃～30℃，超声功率为100～200W。

步骤(3)中，所述的膜为聚碳酸酯膜，混合体系先过0.4～0.8μm的膜10～20次，再过0.03～0.2μm的膜10～20次。

上述制备方法制备得到Decoy核酸阳离子脂质体载体也在本发明的保护范围之内。

上述Decoy核酸阳离子脂质体载体在作为携带药物穿透细胞膜和细胞核的药物输送系统中的应用也在本发明的保护范围之内。

有益效果：本发明与目前市面上最常用的转染试剂lipo2000相比，在使用hek293作为转染细胞时，入膜率提高了30％，入核率提高了90％；与市面转染效率最好的lipo3000相比转染效果基本持平，同时不具有细胞毒性。

附图说明

图1：A为DOPE结构，B为DOTAP结构示意图。

图2：核酸：LMWP：脂质体复合物示意图，其中，A为脂质体层，B为DNA，C为LMWP；dDNA为两DNA分子轴间距，δw为脂质层厚度，δm为DNA分子厚度；

图3A为实施例1阳离子脂质体平均粒径检测图；

图3B为实施例1阳离子脂质体zeta电位的检测结果图；

图4A为lipo2000转染效果图；

图4B为lipo3000转染效果图；