[发明专利]一种深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法。

背景技术

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，ferulicacid esterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，是一种新型酶制剂，它主要以阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和木质素阿魏酸酯为底物，破坏阿魏酸与多糖相连的酯键，从植物细胞壁中释放阿魏酸，让余下的多糖主链易被降解，有效提高了含有大量木质纤维素和阿魏酸的副产品的营养价值。阿魏酸具有多种生理功能如清除自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突变、防癌、增强精子活力以及调节人体免疫等。因此，在食品工业中可利用该酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，获得功能性食品基料。阿魏酸酯酶在食品工业中具有广阔的应用前景。

在饲料工业中，农作物植物性的纤维原材料经过阿魏酸酯酶处理后，阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，植物材料致密的细胞骨架结构受到破坏，打破了木质素、半纤维素及纤维素之间的连接，这种疏松的植物性原料更容易被牲畜消化吸收利用，可显著提高饲料的利用率。

纤维素酶是一类能降解纤维素中β-1,4糖苷键的O-糖基化水解酶。在饲料业生产中，纤维素酶作为一种新型的饲料添加剂，添加剂量一般在0.1％-0.3％。由于植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的，阻止了动物对植物细胞内营养物质的消化吸收，纤维素酶能在动物体内分解结构复杂的纤维素，摧毁植物细胞壁并释放营养物质，生成易于消化的葡萄糖，使饲料的利用率增大，同时增进酸度，激活胃蛋白酶，促进消化吸收；纤维素酶还能显著减少动物肠道内大肠杆菌的数量并促进有益微生物的生长，改善肠道内菌群平衡。

目前已经筛选到多种分泌阿魏酸酯酶和纤维素酶的微生物菌株，包括真菌、细菌和酵母。发现的产阿魏酸酯酶微生物主要有黑曲霉(Aaspergillusniger)、链霉菌(如Streptomycesavermitilis)、梭菌(如Clostridiumthermocellum)、杆菌(如Bacillussp.)、乳酸杆菌(Lactobacilli)、假单胞菌(如Pseudomonasfluorescens)等。但绝大多数阿魏酸酯酶从真菌中分离得到，如米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile)、黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、青霉类(Penicillium)。

目前，阿魏酸酯酶在饲料工业中的需求很大，而应用于工业的阿魏酸酯酶主要来源于黑曲霉，由于黑曲霉阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，在工业生产使用过程中，阿魏酸酯酶酶活损失严重，很大程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。本发明的产阿魏酸酯酶的菌株为深绿木霉(Trichoderma atroviride)，为第一次报道，而且该菌株除了产生阿魏酸酯酶以外，还高产高活性的纤维素酶。同时所产阿魏酸酯酶具有很强的耐热性、耐酸性。这些特性非常适合其在饲料工业中应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的准备、孢子悬液的制备、种子液制备、摇瓶液体发酵、复合酶制剂的制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂，该复合酶制剂耐高温、酸碱稳定性好。

所述的深绿木霉(Trichoderma atroviride)AWS26，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号：CGMCC No.8673。

所述气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，包括以下步骤：

步骤1，发酵菌种的准备：将深绿木霉菌种Aws26在PDA活化培养基上划线活化，置于37-40℃恒温培养箱中培养48-72h，得活化菌种；