[发明专利]一种深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法

权利要求书

1.一种深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，发酵菌种的准备：将深绿木霉（Trichoderma atroviride）Aws26菌种在PDA活化培养基上划线活化，置于37-40℃恒温培养箱中培养48-72h，得活化菌种；

所述深绿木霉（Trichoderma atroviride）AWS26，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号：CGMCC No. 8673；

步骤2，制备深绿木霉孢子悬液，从步骤1所得活化菌种中刮取深绿木霉菌丝，转移至深绿木霉孢子培养基上，置于37-40℃生化培养箱内培养72h至菌丝长出孢子，经两次传代培养恢复其活力，以含有0.01%吐温80的无菌水洗涤收集孢子，制备孢子含量为1.0×10⁸CFU/mL的孢子悬液；

步骤3，制备一级种子液：将步骤2所得孢子悬液以5-6v/v%的接种量接入装有150-200mL种子培养基的锥形瓶中，37-42℃摇床培养32-48h，转速160-180r/min，得一级种子液；

步骤4，复合酶气升式发酵：将步骤3所得一级种子液以5-8%的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐压0.05Mpa，40-42℃初始发酵2d，发酵培养基初始pH4.5-6.0，无菌空气通风比1:0.6-0.8，发酵2d至4d，发酵温度降为32-37℃，无菌空气通风比1:0.4-0.6，pH调节至6.0-6.5，发酵结束得粗酶液；

步骤5，复合酶制剂的制备：将步骤4所得粗酶液中加入保护剂2-3wt%的糊精、1-3wt%的可溶性淀粉、0.1-0.2wt%的山梨酸钾，搅拌分散后，-20℃冷冻8-10h， 30-40Pa、-35℃冷冻15-18h，即得复合酶制剂。

2.根据权利要求1所述的深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤1中的PDA活化培养基配方为：土豆浸出液100mL，无机盐液1mL，蔗糖2g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃灭菌15min。

3.根据权利要求1所述的深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤2中的深绿木霉孢子培养基配方为：土豆浸出液50mL，麸皮浸出液50mL，蔗糖1g，琼脂粉1.5g，pH5.0-6.0，121℃灭菌15min；其中，土豆浸出液：土豆削皮切成1cm³小块，称取200g，加入1000mL水，煮沸30min，过滤，定容到1000mL；麸皮浸出液：50g麸皮加入300mL水，煮沸30min，过滤，定容到200mL。

4.根据权利要求1所述的深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中的一级种子培养基配方为：麸皮粉5g，麦芽糖4g，蔗糖3g，蛋白胨5g，玉米浆10g，尿素2g，微量元素4-5mL，加去离子水至1000mL，pH5.5，121℃灭菌20min。

5.根据权利要求1所述的深绿木霉气升式发酵罐发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤4中的发酵罐发酵培养基配方为：麸皮粉8g，花生壳粉5g，豆饼粉12-15g，纤维素粉3-5g，玉米浆10-15g，蛋白胨5-10g，尿素3-4g，(NH₄)₂SO₄ 3-5g，牛肉膏2-5g，NaCl 2-5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.04g、CaCl₂ 0.3-0.5，吐温20 2g，微量元素4-5ml，去离子水1000mL，pH6.5-6.8，121℃灭菌30min。