[发明专利]一种PD-1抗体检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体检测试剂盒，特别是涉及一种PD-1抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术

在正常情况下，机体免疫反应激活产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以杀死体内的肿瘤细胞。肿瘤的免疫抑制作用是肿瘤细胞逃避机体免疫系统杀伤的重要机制。肿瘤免疫学领域的最新研究发现，程序性死亡分子-1(PD-1)介导的免疫抑制反应是CTL发生凋亡、无力以及功能耗竭的重要原因。肿瘤细胞及其肿瘤相关的免疫抑制性细胞表面表达B7-H1/4分子，它们是已知的PD-1配体，当CTL进入肿瘤微环境时，CTL细胞表面的PD-1会被其配体激活，引发胞内的SHP1/2的磷酸化，进而导致细胞凋亡或功能耗竭，从而无法有效杀伤肿瘤细胞。

目前，通路阻断剂抗PD-1和B7-H1/4单克隆抗体的相关研究具有突破性的进展，研究发现其能阻断PD-1对T细胞的抑制作用，从而激活肿瘤患者体内的免疫细胞杀瘤效应，减少抑制性调节T细胞效应，以增强CTL杀伤癌细胞的功能，其已成为近年来免疫治疗的热点。多项荷瘤动物实验结果表明，阻断PD-1通路可以增强抗肿瘤效应、延长生存期、改善预后。针对PD-1通路阻断的单克隆抗体用于进展期恶性黑色素瘤的三期临床试验已经完成，其抗肿瘤效果显著，已被美国FDA批准为可上市药物。由于PD-1抗体的广谱抗癌作用，其对肾癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病、头颈癌、肠癌和脑瘤等癌症的临床疗效研究也正在二期或三期临床试验之中。

PD-1抗体作为一种新型、安全、高效的抗肿瘤药物，势必将在临床肿瘤治疗中被大量应用，科研领域也会对该药物的剂型、药代动力学等做深入的研究，因此迫切需要一种针对PD-1抗体的特异性检测方法。

双抗体夹心法酶联免疫技术是目前对蛋白质类物质进行精确定量最为有效的方法，其原理是将待测蛋白的一种抗体包被至固相载体(例如酶标板)上，用于特异性捕获待测蛋白，然后采用待测蛋白的另一种标记抗体(例如偶联HRP的二抗等)进行标定和检测。然而，PD-1抗体本身就是一种IgG抗体，其具有与相同物种来源IgG相同的结构，大部分区域(约2/3序列)为恒定区，同一物种的IgG恒定区的氨基酸序列和结构相同，不同物种的IgG恒定区根据进化程度不同具有不同程度的同源性；可变区主要是结合特异性抗原结构域，由于难以获得针对可变区的抗IgG抗体，因此一般不会采用该区的表位制备二抗。如果采用针对恒定区表位的两种抗IgG抗体，显然无法排除待测血清、组织液等样本中本身含有的IgG的干扰，因此传统的双抗体夹心法无法实现对PD-1抗体的特异性检测。目前，尚无有效的精确测量PD-1抗体浓度的方法，尤其如何测定动物或人血清中PD-1抗体的浓度成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种PD-1抗体检测试剂盒及其应用，用于解决现有技术中的双抗体夹心法无法实现对PD-1抗体的特异性检测等技术缺陷。

本发明提供一种PD-1抗体检测试剂盒，包括固相载体、抗体捕获剂和标记抗体，所述抗体捕获剂为PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

在本发明的PD-1抗体检测试剂盒中，PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白能够特异性捕获待测样本中的PD-1抗体，其可以通过普通市售获得，例如可以采用ACRO Biosystems公司生产的货号为PD1-M5228的重组蛋白；标记抗体能够特异性地与PD-1抗体结合并且偶联有产生检测信号的物质(例如辣根过氧化物酶、链霉素等)。

该试剂盒的工作原理是：将待测样本加入到预包被抗体捕获剂的固相载体后，抗体捕获剂特异性捕获待测样本中的PD-1抗体，随后加入的标记抗体特异性地与PD-1抗体结合，通过对标记抗体上偶联物质产生的检测信号进行检测，从而能够得到待测样本中PD-1抗体的浓度。

可以理解的是，在本发明的PD-1抗体检测试剂盒中，固相载体和抗体捕获剂可以独立进行包装，也可以预先将抗体捕获剂预包被在固相载体上形成预包被固相载体，从而对预包被固相载体进行包装。

在本发明中，所述标记抗体可以为辣根过氧化物酶或链霉素标记的IgG抗体；特别是，该标记抗体与PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白的来源物种相同，在一实施方式中，PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白来源于小鼠，标记抗体可为辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗大鼠IgG抗体。所述固相载体可以采用本领域常规载体，例如酶标板。