[发明专利]高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法

权利要求书

1.高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，其特征在于，

所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮；

采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述10种类固醇激素，先利用高效液相色谱将10种类固醇激素分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述10种类固醇激素的含量，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；

流动相B：0.1％v/v甲酸的甲醇溶液；

色谱柱型号：Phenomenex C18 100mm×2.1mm，2.6μm；

采用梯度洗脱的方式，见表1；

流速为0.5mL/min，柱温为35℃，进样体积为20μL；

表1 流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为Medium；气帘气为40kPa；离子源雾化气和加热辅助气均为60kPa；去溶剂温度为550℃；同时监测了目标物孕酮(m/z 345.093→124.1)、孕烯醇酮(m/z 332.0→86.2)、17α-羟孕酮(m/z 361.0→112.2)、17-羟孕烯醇酮(m/z 348.0→330.3)、雄烯二酮(m/z 317.0→112.2)、脱氢表雄酮(m/z 304.2→253.2)、睾酮(m/z 304.1/112.2)、双氢睾酮(m/z 306.2→81.1)、皮质酮(m/z 410.0→377.2)和雌酮(m/z 286.0→253.0) 以及同位素内标d2-雌酮(m/z 288.0→255.1)、d6-脱氢表雄酮(m/z 310.3→219.2)、d8-17α-羟孕酮(m/z 269.2→115.1)和d3-睾酮(m/z 307.0→112.2)；各个目标物的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数见表2；

表2 10种类固醇激素质谱参数

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素

的方法，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，其特征在于，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL 100ng/mL混合内标液B，再加入600μL MTBE，然后涡旋数秒后振荡15min，14000r/min离心5min后取400μL上清液用氮吹仪吹干，再加入80μL 1.5mol/L羟胺，涡旋5秒后振荡15min，放入恒温箱60℃衍生化反应1h。

4.根据权利要求3所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，其特征在于，所述的混合内标液B按如下方法制备得到：分别准确称取10.0mg氘代同位素内标品，包括d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、d8-17α-羟孕酮、d2-雌酮和d9-孕酮，分别加入10mL甲基叔丁基醚完全溶解，得到浓度均为1.0mg/mL的5种同位素内标溶液，然后用甲醇将这5种同位素内标溶液的浓度均由1.0mg/mL稀释至1.0μg/mL，接 着各取1mL浓度为1.0μg/mL的5种同位素内标溶液加水定容至10mL，配制得到浓度均为100ng/mL的混合内标液B。