[发明专利]一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒，其特征在于：包括包被有抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的平台载体、不同浓度氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品、氧化低密度脂蛋白质控品、生物素标记的氧化低密度脂蛋白克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、样本缓冲液、底物A、底物B、终止液、浓缩洗液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述平台载体为微孔板；所述氧化低密度脂蛋白克隆抗体为氧化低密度脂蛋白单克隆抗体；所述样本缓冲液为含有蛋白保护剂的磷酸盐缓冲液，所述底物A为过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液；所述底物B为四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗液为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒微孔板上抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的数量为1-50μg/孔；氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品为6支、各2ml；所述氧化低密度脂蛋白质控品为2支各2ml；生物素标记的氧化低密度脂蛋白单克隆抗体10ml、1支；辣根过氧化物酶标记的亲和素10ml、1支；样本缓冲液10ml、1支；底物A 10ml、1支；底物B 10ml、1支；终止液10ml、1支；浓缩洗液10ml、1支。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品和氧化低密度脂蛋白质控品都是用氧化低密度脂蛋白纯品与氧化低密度脂蛋白标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的氧化低密度脂蛋白标准品稀释液，是在pH 7.0-8.0、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样本缓冲液是在pH6.0-7.0、浓度为10-100mM的磷酸盐缓冲液中，分别加入0.1-3mM的金属离子络合剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.01-1％质量分数的表面活性剂、0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成；所述底物A是将过氧化氢纯品加入到浓度为50-100mM柠檬酸盐缓冲液中配制而成；所述底物B是将四甲基联苯胺加入到浓度为50-100mM柠檬酸盐缓冲液中配制而成；所述浓缩洗液是把质量分数为0.05-1％的表面活性剂加到pH6.0-7.0、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中配制而成。

7.根据2-6任意一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为曲达通X-100、吐温20、布里杰-35、吐温40、十二烷基磺酸钠、聚乙二醇2000。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述的金属离子络合剂为乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸。

9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的蛋白保护剂为牛血清白蛋白、甘油、蔗糖；所述防腐剂为Proclin 300。

10.制备如上任意权利要求所述的试剂盒的方法，其特征在于：包括以下步骤，不分前后顺序：

包被有抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的平台载体的制备：将浓度为6-10mg/ml的特异性抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体用浓度为20-50mM的磷酸盐缓冲液稀释到浓度为1-3μg/ml，加入到平台载体上，4-8℃过夜进行包被；然后用浓缩洗液将平台载体清洗至少3次；再向平台载体上加入含蛋白保护剂的封闭液进行封闭；等待平台载体至干燥后，真空袋封装，4-8℃存放；

氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品和氧化低密度脂蛋白质控品的制备：是用氧化低密度脂蛋白纯品与标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释，最后配制成标示浓度为0-1000ng/ml的氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品以及80-500ng/ml的氧化低密度脂蛋白质控品；其中标准品稀释液是在pH 7.0-8.0、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1％-4％质量分数的动物血清、0.05-0.5％质量分数的防腐剂、3-5％质量分数的蛋白保护剂、0.1-0.5％质量分数的表面活性剂；将得到的氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品与氧化低密度脂蛋白质控品每瓶500ul分装，然后冻干成粉末状，4-8℃保存；

生物素标记的氧化低密度脂蛋白克隆抗体制备：在偶联前将生物素活化；然后将浓度为1-5mg/ml待标记的氧化低密度脂蛋白抗体用50-100mM碳酸盐缓冲液稀释到浓度为1-2mg/ml，并用稀释后的碳酸盐缓冲液透析6-15h后；将活化后的生物素溶解于二甲基亚砜纯品中待用，把处理后的氧化低密度脂蛋白抗体溶解到于50-100mM碳酸盐缓冲液中，按体积比1:6-1:10混合含有生物素活化的二甲基亚砜和含有氧化低密度脂蛋白抗体的碳酸盐缓冲液，在室温下温育4h后用PBS透析纯化；将所得生物素标记氧化低密度克隆抗体加入0.02％质量分数的NaN₃等体积混合，分装后，4℃避光保存，或者将所得生物素标记氧化低密度克隆抗体加入50％质量分数的甘油，-15—-20℃保存备用；

辣根过氧化物酶标记的亲和素的制备：称取过碘酸钠加入到纯净水中配置得到终浓度为10-15mg/ml的过碘酸钠溶液；将终浓度为10-15mg/ml的过碘酸钠溶液与浓度为1-2mg/ul的辣根过氧化物酶等比例混合得到被过碘酸钠氧化过的辣根过氧化物酶；然后将亲和素用浓度为10-100mM的磷酸盐缓冲液溶解透析，透析后的亲和素用碳酸盐缓冲液等体积混合稀释；再将氧化过的辣根过氧化物酶与浓度为1-2mg/ml亲和素等体积混合后在4-8℃透析10-12h；用去离子水溶解硼氢化钠成终浓度为8-12mg/ml，然后按照亲和素-HRP与硼氢化钠溶液体积比1:8-12混合，置于4℃，2h；取等体积的饱和硫酸铵溶液，加入到标记混合溶液中，置于4℃沉淀1h；将得到的产物8000r/min，4℃，离心20min；去掉上清液，用1ml、20mM、pH7.4的PBS复溶沉淀物；将得到的复溶溶液加入到分子筛小柱子中，接取有颜色的部分；该有颜色的部分即为标记好的酶标亲和素，将标记好的酶标亲和素与甘油1:1等体积混合，-15—-20℃保存备用。

样本缓冲液的配制：所述样本缓冲液是在PH6.0-7.0、浓度为10-100mM的磷酸盐缓冲液中，分别加入0.1-3mM的金属离子络合剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.01-1％质量分数的表面活性剂、0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成；

底物A：将过氧化氢纯品加入到浓度为10-100mM柠檬酸盐缓冲液中，配制成过氧化氢质量分数为20-50％的柠檬酸盐混合溶液；

底物B：将四甲基联苯胺加入到浓度为10-100mM柠檬酸盐缓冲液中，配制成四甲基联苯胺质量分数为5-20％的柠檬酸盐混合溶液；

终止液：将浓硫酸加水稀释至1M；

浓缩洗液：把质量分数为0.05-1％的表面活性剂加到PH6.0-7.0、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，然后混匀。