[发明专利]筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片及应用

说明书

技术领域

本发明涉及活性细菌的微生物筛选和进一步的活性成份筛选，特别涉及筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备及应用，主要是一种在纸上丝网套印包括样本细菌-模型细菌的对偶微室共同培养、分离成份部位-模型细菌的对偶微室、2-维电泳以及细菌呼吸电化学测量阵列等单元的纸基2-维电泳微流控芯片。

背景技术

1928年Alexander Fleming发现青霉素和抑菌环(A.Fleming,1929,12,226-236)。12年后弗洛里和钱恩分离得到第一个临床应用抗生素---青霉素。Lewis(K.Lewis,2012,485,439-440)指出，在抗生素发现黄金时代(40～60年代)大多数抗生素从土壤源放线菌中被筛选出来，但该法收益递减，20年后这类方法和平台却不灵了，随后从合成化合物筛选，也因多数缺乏透过细菌包膜能力也努力失败。他强调思考抗菌发现的黄金时代，不要放弃过去成功的筛选土壤细菌的方法。

当前在环境污染抗性细菌普遍出现和繁衍的情况下，唯有采用现代先进技术才能保持我们期望的抗菌素耐药和新药发现的平衡，从而使往日成功得以复制。Kaeberlein等设计了一个模拟海洋沉积物在0.03μm孔径聚碳酸酯膜间形成微生物扩散生长室，来孵育不可培养的(野生)海洋微生物的自然生长(T.Kaeberlein et al.,2002,296,1127-1129)。Nichols(D.Nichols et al.,2010,76,2445-2450)等使用一种新型隔离芯片，原位地、高通量地从不同环境中分离、并培养了‘野生’微生物物种。这种芯片包含数百个可接种单个细胞的微扩散室，形成庞大且多样的阵列排布，能够发现先前难以培养的微生物。Huacca等采用聚二甲基硅氧烷PDMS喷墨打印纸基便携装置来培养细菌(M.F.Huacca et al.,2012,12,4269-4278)。但是，这些芯片都没有包含阵列样本细菌-模型细菌对偶微室这样的活性细菌筛选单元，也不涉及活性细菌的次生代谢产物经过2-维分离后的阵列活性成份筛选单元。

目前，复杂抗生素样品(如细菌次级代谢物)通常采用毛细管电泳-质谱(P.I.Koczka et al.,2014,35,2534-2537)或液相色谱-质谱(M.Gbylik-Sikorska et al.,2015,119,8-15)分离检测；微流控芯片包括纸基微流控芯片(E.K.Sackmann et al.,2014,507,181-189)包含自动进样、样品预处理等多个功能也被广泛应用于复杂样品(如活性细菌次级代谢产物)的分离和检测；Shameli等基于2-维微流控芯片分离蛋白质并采用荧光标记蛋白进行检测(S.M.Shameli et al.,2015,87,3593-3597)。2007年Martinez等提出光刻法实现复杂图案的亲水区域和通道，并利用纸基自动虹吸输液的纸基微流控芯片(A.W.Martinez et al.,2007,46,1318-1320)。其实，Gross早在1959就采用2-维纸基平板电泳分离和苦味酸色包含至少27种氨基酸和酰胺的复杂生物样品(D_R.D.Gross,1959,184,1298-1301)。上述文献说明，2-维纸基平板电泳特别是具有相间电泳通道(有降低焦耳热的优点)的2-维垂直通道的纸基电泳芯片应该具有强大的分离复杂生物样品(如活性细菌次级代谢产物)的能力，但通过质谱、荧光标记蛋白或苦味酸染色检测等都不能直接地(原位地)筛选成份的活性。

纸基电化学传感器作为测向流动和微流控装置，其便宜、快速、灵活和容易使用在及时检测中得到越来越多的应用(B.W.Liu et al.,2014,26,1214-1223)。Wang等把大肠杆菌固定到普通碳电极，通过氢醌阳极电流指示毒物影响细菌呼吸程度(H.Wang et al.,2008,19,211-214)；Yu等在重金属毒物和苯醌溶液环境孵育大肠杆菌，用铂微电极工作电极-饱和KCl溶液Ag/AgCl参比电极-铂丝对电极反映毒物毒性的氢醌阳极电流(D.B.Yu et al.,2013,138,3297-3302)。

申请号为201410392974.9的中国发明专利，公开了一种纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法，该方法基于微生物呼吸链-对氢醌体系电化学检测原理，在丝网印刷PDMS亲水微通道和碳浆三电极系统的纸基微流控芯片上，但是该专利不能用于筛选土壤活性细菌和成份，因此，必须发展高自动化程度、高通量、低成本、全程一体化的微流控平台技术，才能实现在污染抗性环境下土壤细菌新抗菌素的有效地筛选。