[发明专利]筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片及应用

权利要求书

1.筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、设计多功能纸基微流控芯片

(1.1)、设计第一维的等电聚焦电泳IEF分离通道(2)，该通道与左侧缓冲液池(3)和右侧缓冲液池(4)相连，在该通道左侧缓冲液池(3)的纸基背面设计进样纸条(25)并与缓冲液(26)相连，再在该通道右侧缓冲液池(4)的纸基背面设计进样纸条(25)并与缓冲液(26)相连，并在该通道的左侧设计碳浆+电极(5)和右侧设计碳浆-电极(6)；

(1.2)、设计纸基阵列活性细菌筛选功能单元(1)，该阵列功能单元紧邻IEF分离通道(2)上方，并沿该通道紧密地阵列分布；

(1.3)、设计第二维的竖直、平行且间隔、阵列的毛细管区带电泳CZE分离通道(7)，该阵列通道位于第一维IEF分离通道(2)的下方，而且垂直并连接IEF分离通道(2)的不同位置，平行阵列CZE分离通道(7)的上方共用碳浆+电极(8)和下方的共用碳浆-电极(9)，在每个CZE分离通道(7)上方与IEF分离通道(2)垂直连接的纸基背面各个位置C₁₊，C₂₊，...处设计进样纸条(25)，进样纸条(25)并与缓冲液(26)相连，作为该阵列CZE的+极缓冲液池；同理，在CZE分离通道(7)道下方的纸基背面各个位置C_1-，C_2-，...处也设计进样纸条(25)并与同样缓冲液(26)相连，作为该阵列CZE的-极缓冲液池(10)，以保证不同位置的已完成IEF第一维分离的活性细菌次生代谢物成份迅速进入邻近的相应CZE分离通道(7)，开始CZE第二维分离；

(1.4)、设计纸基阵列活性成份筛选单元(11)，该功能单元是沿各阵列CZE分离通道(7)左侧最大紧密地阵列均匀排布的，在完成CZE活性细菌次生代谢产物第二维分离后，在2-维分离和模型细菌纸基层I的下层另外加一层模型细菌纸基层II，使得独立阵列模型细菌培养室(15)阵列分布于CZE分离通道(7)正下方，并通过紧密接触使对应位置的阵列活性成份筛选单元(11)与CZE分离通道(7)导通，保证CZE分离通道(7)经2-维分离的、各个位置的次生代谢产物成份独立地扩散到其邻近的各个阵列活性成份筛选单元(11)里面；

(1.5)、设计最下层的培养基-阵列电极纸基层III，该纸基层III包含着独立阵列的培养基供给单元，每个供给单元包括了直道的培养基供给通道(12)和弯道的培养基供给区(13)，以及处于纸基层I的模型细菌培养室(14)和纸基层II独立阵列模型细菌培养室(15)的碳浆三电极结构单元(16)，碳浆三电极结构单元(16)与其上层的阵列活性细菌筛选功能单元(1)的位置相对应；

步骤二、制作多功能纸基微流控芯片

(2.1)、丝网印刷碳浆电泳电极、PDMS活性细菌筛选功能单元、2-维分离通道和模型细菌，依据步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作左侧碳浆+电极(5)、右侧设计碳浆-电极(6)和上方共用碳浆+电极(8)、下方共用碳浆-电极(9)的丝网印刷网板A，在第一层色谱纸的正面丝网印刷这四个碳浆电泳电极，150℃烘1小时；再依据步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作阵列活性细菌筛选功能单元(1)中的模型细菌培养室(14)和样本细菌培养室(17)、IEF分离通道(2)、左侧缓冲液池(3)、右侧缓冲液池(4)、CZE分离通道(7)和CZE的-极缓冲液池(10)的网板B，再在第一层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷，形成第一层色谱纸上包含正面的碳浆电泳电极、背面的细菌培养室和2-维分离通道层的结构，灭菌处理；再制作阵列活性细菌筛选功能单元(1)中的模型细菌培养室(14)构型的网板C，再在模型细菌培养室(14)内，在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第一层的2-维分离和模型细菌纸基层I；

(2.2)、活性成份筛选功能单元的PDMS结构和模型细菌的丝网印刷，依据步骤(1.4)的设计制作阵列活性成份筛选功能单元(11)的构型的丝网印刷网板D，在第二层色谱纸用质量比8:1的PDMS和TEOS液态胶混合物丝网印刷，得到包含阵列活性成份筛选单元(11)中的独立阵列模型细菌培养室(15)的色谱纸，并灭菌处理；再在该独立阵列模型细菌培养室(15)内，进一步在无菌环境下丝网套印模型细菌明胶，构成了第二层的模型细菌纸基层II；

(2.3)、阵列碳浆三电极的碳浆丝网印刷，依据步骤(1.5)设计的碳浆三电极结构单元(16)，先制作阵列活性细菌筛选功能单元(1)和阵列活性成份筛选单元(11)中的所有阵列三电极结构(16)丝网印刷的网板E，再在第三层色谱纸的正面上进行碳浆丝网印刷，150℃烘1小时，得到处于最下层的阵列碳浆三电极色谱纸，碳浆三电极结构单元(16)包含对电极(18)、工作电极(19)和参比电极(20)；

(2.4)、培养基供给单元的PDMS丝网印刷，先制作包含直道的培养基供给通道(12)和弯道的培养基供给区(13)的培养基供给单元(21)结构的丝网印刷网板F，再在第三层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS与TEOS液态胶混合物丝网印刷，75℃烘1小时，形成培养基供给单元(21)，培养基供给单元(21)和阵列碳浆三电极结构单元(16)共同构成了第三层的培养基-阵列电极纸基层III，并灭菌处理；

(2.5)、依次按照对应位置从上至下第一层I、第二层II和第三层III叠放印刷有上述结构的色谱纸，进而构成了多功能纸基微流控芯片的核心结构IV；

步骤三、形成具有土壤细菌原位培养、活性土壤菌筛选、次生代谢物2-维电泳分离和活性成份筛选多功能单元的完整纸基微流控芯片V：

(3.1)、将不同地点的土壤进行编号，用经灭菌的0.2μm聚碳酸酯膜覆盖包裹，滴加一定量培养基溶液使得土壤潮湿，形成聚碳酸酯膜封装的土样(22)，该过程在无菌一定湿度的环境下操作，作为样本菌的来源；

(3.2)、将聚碳酸酯膜封装的土样(22)放置在多功能纸基微流控芯片的核心结构IV上，使土样(22)位于样本细菌培养室(17)的上方，再用0.03μm聚碳酸酯膜(23)来包裹土样(22)和多功能纸基微流控芯片的核心结构IV表面，得到多功能纸基微流控芯片。

2.基于权利要求1所述制备方法所得到的筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片的应用，用多功能纸基微流控芯片进行活性细菌筛选、次生代谢产物的2-维电泳分离以及活性成份的筛选，包括以下步骤：

(1)、活性细菌筛选单元中模型细菌和样本细菌的培养基供给，通过泵或纸基自动虹吸液体培养基沿直道的培养基供给通道(12)和弯道的培养基供给区(13)，来培养模型细菌和样本细菌，其中样本细菌应与聚碳酸酯膜封装土样(22)湿润接触；

(2)、样本细菌的获取，以及样本细菌与模型细菌扩大培养，聚碳酸酯膜封装土样(22)与样本细菌培养室(17)进行湿润接触，土壤样本细菌由0.2μm微孔进入样本细菌培养室(17)，样本细菌再进行进一步扩大培养，获取较大量的样本细菌及其次生代谢产物，同时，模型细菌菌落也在其模型细菌培养室(14)内生长，从而形成样本细菌-模型细菌的对偶微室共同培养阵列单元，在该扩大培养的过程中，样本菌落的次生代谢产物逐步扩散穿过模型细菌培养室(14)和样本细菌培养室(17)之间的亲水区域(24)，进而与模型细菌菌落作用而抑制其呼吸或生长；

(3)、阵列纸基微流控芯片生物毒性阳极电流检测筛选土壤活性菌，通过机器人或人工阵列同时滴加苯醌(BQ)于阵列排布的模型细菌培养室(14)，导通阵列碳浆三电极(16)，以单电位阶跃计时电流法同时检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的土壤活性细菌；

(4)、土壤活性细菌的活性次生代谢产物进入第一维的IEF分离通道，实现IEF分离，将筛选出的土壤活性菌落位置的分布于纸基上次生代谢物产物剪切折叠，并置于第一维的IEF分离通道(2)中间位置，通过位于左侧缓冲液池(3)和右侧缓冲液池(4)背面的进样纸条(25)分别插入盛有不同pH缓冲液(26)的小容器(27)，不同pH的缓冲液(26)包括pH 3.0磷酸盐和pH 10.0磷酸盐，并在左侧碳浆+电极(5)、右侧设计碳浆-电极(6)加合适电压，完成土壤活性细菌分泌的次生代谢物产物的第一维IEF分离；

(5)、活性次生代谢产物的第二维分离，经第一维IEF分离后，把C₁₊，C₂₊，...，和C_1-，C_2-，...，多组对应的进样纸条(25)插入盛有缓冲液(26)的小容器(27)，在上方共用碳浆+电极(8)、下方共用碳浆-电极(9)加电压，进行次生代谢物产物的第二维CZE分离；缓冲液(26)包括pH 3.0磷酸盐；

(6)、用纸基阵列生物传感器原位筛选2-维电泳分离的活性成份，经第二维CZE分离后，使模型细菌纸基层II与包含碳浆电泳电极、2-维分离通道和模型细菌纸基层I紧密接触，使纸基层II上的独立阵列模型细菌培养室(15)与纸基层I上对应的阵列CZE分离通道(7)完全吻合，通过机器人或人工阵列同时滴加苯醌于独立阵列模型细菌培养室(15)，依次瞬间间隔导通阵列碳浆三电极(16)，仍以单电位阶跃计时电流法同时原位地检测阵列模型细菌菌落呼吸产生的电流大小，电流显著较小的菌落应为所筛选的活性成份。