[发明专利]基于芯片进行规模化快速制备单根寡核苷酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及芯片合成寡核苷酸的技术领域，特别是涉及单根寡核苷酸低成本规模化制备方法。更具体的说，本发明涉及利用聚丙烯酰胺凝胶分离方法对芯片合成所得的寡核苷酸混合物进行分离的方法。本发明还涉及针对单根寡核苷酸快速制备方面的芯片上寡核苷酸库的设计方法。

背景技术

标准的DNA化学合成是从3’端到5’端延长核苷酸链的循环过程。二十世纪八十年代，已经发展了四步法亚磷酰胺化学合成方法[1]。这个方法现在仍被大多商业化DNA合成公司所采用。该过程将酸活化的脱氧核苷亚磷酰胺(Deoxynucleoside phosphoramidite)分子耦合到一个被固定在固相上(一般是硅材质表面)的脱氧核苷酸分子上。在第一个合成循环中，核苷酸链将从第一个被固定在表面的受保护的核苷酸分子开始延伸。其中，经常采用的固定化表面主要是可控孔度玻璃(controlled pore glass，CPG)或者聚苯乙烯珠子(polystyrene beads,PS beads)。目前，基于四步法合成方法的DNA全自动合成仪已经可以将单次合成的通量从1根提高到1,536根序列[2]。目前，商业化提供的CPG合成长寡核苷酸(<60nt)的价格可以达到$0.10-0.20/nt，较长的寡核苷酸及进一步合成的基因价格大约是$0.40-1.00/bp[3]。

传统的DNA合成方法受到通量和成本限制，合成的寡核苷酸只能充当PCR或者定点突变的引物。但随着DNA化学合成技术的发展，尤其是基于微阵列技术的并行合成寡核苷酸合成技术的发展[4][5,6]，大量寡核苷酸序列可以在几厘米见方的芯片上并行合成，通量得到提升，对应的成本也随之降低，可以直接应用到代谢工程改造、药物开发、基因组功能分析等领域。

人工合成的高保真的寡核苷酸多用来制作单链核酸探针，检测序列特异性的分子，包括DNA与蛋白质、药物或其他配体分子之间的相互作用，从而应用到核酸杂交、原位杂交荧光检测(FISH)、噬菌体展示、核磁共振NMR等技术中[7]。另外，DNA或RNA可以在细胞内结合序列互补的基因组DNA或转录的mRNA，造成基因沉默或蛋白表达水平下调，引起表型的改变。因此，寡核苷酸也可以应用到基因功能检测、基因治疗相关的药物开发等方面。比如，双链DNA寡核苷酸可以作为检测哺乳细胞对外源DNA相关应答的工具[8]，也可以用来作为敲除细胞内相关基因序列或调控序列从而研究基因功能的工具。

另外，蛋白表达相关调控因子，如启动子、核糖体结合位点等序列都是短的DNA(即寡核苷酸)序列，这种类型的寡核苷酸可以直接进行人工合成。因此，研究者们可以通过理性设计和构建寡核苷酸文库，来达到优化蛋白质表达的目的。如Schlabach,M.R.等人通过人工设计合成了一套启动子文库，分别克隆到含有GFP基因的表达载体中，控制表达蛋白产生荧光信号，经过FACS筛选得到强启动子，用来优化哺乳细胞内蛋白表达水平[9]。