[发明专利]用于以RT‑LAMP法快速检测香蕉病毒的引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及用于以RT-LAMP法快速检测香蕉三种重要病毒(香蕉束顶病毒、香蕉线条病毒及黄瓜花叶病毒)的引物及其检测方法。

背景技术

香蕉是重要的粮食作物、经济作物，在超过130个国家均有种植，并为亚洲、非洲、美洲、大洋洲等的数以百万计的农民提供主要粮食以及经济收入。在2012年，香蕉的总产量达到1.39亿吨以上，种植面积达1030万公顷；香蕉已经成为次于玉米、水稻、小麦、马铃薯以及木薯的第六大粮食作物(来源于FAO 2014年统计数据)。香蕉的种植、收获在全年中不受季节限制，且主要依靠从母株分离吸芽进行繁殖。然而，该种植方式具有明显的缺点，香蕉植株会在不同的生长发育阶段受到各种不利环境因素的影响，如害虫、病原菌等，并导致世界范围内的香蕉病虫害的频繁发生。其中，香蕉病毒病是影响香蕉正常生长的重要制约因素。

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)、香蕉线条病毒(Banana streak virus，BSV)以及黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV))是香蕉病毒中的三种重要病毒；这三种病毒严重影响了香蕉的产量和品质，并制约了香蕉产业的进出口贸易。BBTV、BSV以及CMV分别属于矮缩病毒属(Nanavirus)，杆状病毒属(Badnavirus)以及黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)。然而，由于缺乏抗病品种等有效的病毒病防治方法，有效的防治香蕉病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的基本工具则是灵敏、准确、快速的检测方法。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)能在等温(60～65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增的方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于PCR技术。

LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60分钟内实现10⁹～10¹⁰倍的扩增，使得LAMP同时具备高特异性、高灵敏度以及快速等优点。已有的香蕉病毒的LAMP研究均是单项的，且是分别以DNA和RNA为模板，不适合香蕉组培种苗的快速检测或者田间香蕉植株的快速检测，检测过程较为耗时、耗工和耗钱，容易错过农时，不符合生产实际要求。因此，建立一套以RT-LAMP为基础的多种香蕉病毒的稳定、简便、快速、灵敏的分子检测方法具有应用前景。本发明检测方法直接以香蕉叶片RNA为反应模板，不需分别提取DNA和RNA，减少实验环节，且开发的RT-LAMP检测技术不仅特异、灵敏，而且反应时间短，可在1h内完成检测反应；使用本发明检测方法对香蕉种苗及种植区的植株进行检疫检测，可有效防止香蕉病毒病的扩散与蔓延，确保香蕉的安全生产。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供用于以RT-LAMP法快速检测香蕉三种重要病毒(香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)、香蕉线条病毒(Banana streak virus，BSV)以及黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV))的引物。本发明分别根据BBTV的Coat protein、BSV的RNase H以及CMV的Coat protein的保守基因组序列设计LAMP检测引物，可特异检测各个香蕉病毒。

本发明另一目的在于提供一种采用上述引物以RT-LAMP法快速检测香蕉三种重要病毒的检测方法。

本发明再一目的在于提供上述检测方法的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：