[发明专利]一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法及其试剂盒产品

说明书

本发明提供了一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，其中包括如下特征：来自于癌症患者自身的外周血单个核细胞，在重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC‑I类链相关分子A共同作用下激活了自然杀伤细胞增殖，并增强了自然杀伤细胞杀伤潜能；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的试剂盒，可用于临床大量获得自然杀伤细胞并进行抗肿瘤和抗病毒的治疗。

技术领域

本发明涉及一种鸡尾酒式制备自体自然杀伤细胞的方法，其中包括如下特征：其中包括如下特征：来自于癌症患者自身的外周血单个核细胞，在重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A共同作用下激活自然杀伤细胞增殖，并增强自然杀伤细胞杀伤潜能；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的试剂盒，可在体外大量增殖获得自然杀伤细胞并具有杀伤活性，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK)主要表达CD16+/CD56+表型，是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫及清除非己细胞的第一道防线。与T淋巴细胞不同，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。NK细胞功能的发挥由其细胞表面活化性受体和抑制性受体所传递的信号共同决定，但在癌症患者体内肿瘤细胞通过机体炎症分子抑制NK细胞表面活化性受体表达，表达抑制性受体从而逃避NK细胞杀伤。因而，激活NK细胞高表达活化性受体而活化其杀伤活性就至关重要了，NK细胞对黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等肿瘤治疗有明显疗效。

NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量NK细胞有限和培养时间过长。传统使用的白介素2激活生长倍数有限，端粒长度缩短，培养时间过长引起了NK细胞杀伤功能低下。目前，临床治疗用的NK细胞培养技术也有采用基因工程化和病毒转染的滋养细胞与NK细胞共培养后，激活NK细胞增殖和活化其杀伤功能。

本发明提供了NK细胞鸡尾酒式培养方法，即在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A共同作用下大量扩增NK细胞，30ml外周血来源单个核细胞培养至21天细胞增殖到30×109以上，增殖倍数达到1000倍以上，NK细胞杀瘤活性在14-16天达到最佳，培养过程中不需要基因工程化的滋养层细胞，简单快速，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出最好的抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养成本。

发明内容

本发明针对能更好地从癌症患者自体的单个核细胞扩增获得NK细胞，逆转患者体内NK细胞免疫抑制而增强其杀伤活性。本发明通过前期研究实验发现鸡尾酒式培养方法，即在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子共同作用下诱导激活产生NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到1000倍以上，所述NK细胞经流式细胞仪检测后CD56+/CD16+表型均大于80％，CD3+细胞低于10％，并具有很强杀伤活性。