[发明专利]一种A型口蹄疫标记疫苗及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种A型口蹄疫标记疫苗及其构建方法，属于动物医学与免疫生物学领域。

背景技术

口蹄疫(FMD)是猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传染性极强，其爆发和流行会给畜牧业以及相关行业带来巨大损失，被世界动物卫生组织(FAO/OIE)列为必报疫病之首，我国规定为一类动物传染病。

FMD的病原为口蹄疫病毒(FMDV)，具有7个不同的血清型(A、O、C、AsiaI、SAT I、SAT II和SAT III)和许多的亚型，型间不交叉保护。我国是FMD的重灾国，O型FMD流行已久，且危害最为严重。但近几年来，A型FMD在我国呈现出流行爆发，给我国养殖业造成了巨大的经济损失。传统上，针对O型FMD标记疫苗的研究已经取得了较为显著的进展，但是针对具有鉴别诊断的A型FMD标记疫苗的研究在国内尚未报到。

我国对FMD的防控主要采取以疫苗免疫为主，结合限制动物移动、扑杀染毒病畜及同群畜、封锁、隔离、消毒等一系列综合防控措施。因此，疫苗的免疫保护和精确区分疫苗免疫动物与自然感染动物是FMD防控的两个关键环节。虽然，目前我国上市的A型FMDV灭活疫苗在FMD防控中发挥了重要作用，但面对流行毒的变异和新谱系毒株的传入，需要筛选与当前流行毒株相匹配的疫苗候选株。另外，传统FMD灭活疫苗免疫的动物在血清学上无法与自然感染的动物相区分，而以检测非结构蛋白抗体为金标准的鉴别诊断方法会因疫苗的不完全纯化和动物的多次免疫而影响检测结果，干扰疫病的血清学监控和流行病学调查，阻碍着FMD的控制和根除。因此本领域存在对能与当前流行毒株相匹配，又能够区分自然感染和疫苗免疫的A型口蹄疫标记疫苗的迫切需要。

申请人早期在针对O型FMD疫苗研究时曾研发了一种针对O型口蹄疫的标记疫苗(Marker vaccine或叫DIVA疫苗)，并申请了专利CN102614507A，但口蹄疫病毒型间不交叉保护，因此，此种疫苗不能用于A型口蹄疫的防控。到目前为止，人们已经研发了许多的标记疫苗，包括DNA疫苗，亚单位疫苗，肽疫苗以及利用反向遗传操作技术发展的各种基因修饰的疫苗。但是从疾病流行病学的监控和疫病净化的需求考虑，鉴别诊断的疫苗应该通过缺失病毒免疫优势的表位或某些病毒蛋白来设计。针对这种需求，Fowler VL等通过缺失FMDV结构蛋白G-H环来发展标记疫苗，实际应用表明尽管这个标记疫苗能够完全保护牛对强病毒的攻击并能达到鉴别诊断的目的，但FMDV的G-H环和是主要的中和抗原位点，该区域的缺失，导致疫苗的免疫原性降低，影响免疫效果。Uddowla S等发展了FMDV 3B蛋白缺失和或3D蛋白修饰的A型致弱标记疫苗，实际应用显示此类标记苗能够满足免疫保护和鉴别诊断的需要，但疫苗过度致弱不能诱导良好的保护性的免疫反应。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明公开了一种与当前流行毒株相匹配、免疫原性好、能区分野毒感染和疫苗免疫动物的A型口蹄疫标记疫苗及其构建方法。

具体的说，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种A型口蹄疫标记疫苗，所采用的种毒为具有SEQ ID NO：3基因片段的A/rV-2病毒，该基因片段编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：4，其缺失口蹄疫病毒3A蛋白的104-115位氨基酸。

申请人进行的实验研究表明，上述疫苗对猪等动物的保护效力达到11.84PD50/头份，明显优于OIE推荐的6 PD50的标准，显示了良好的免疫原性。另外，标记病毒感染的动物可以用针对3A AEKNPLE表位的单抗阻断ELISA明显地与野生型病毒感染的动物相区分，可用作发展DIVA疫苗用于我国A型FMD的预防。

本领域技术人员可以理解，作为完整口蹄疫病毒灭活疫苗，需要将种毒进行培养和灭活，然后与佐剂等进行混合制成可直接使用的疫苗，疫苗的生产过程是本领域技术人员所熟知的，此处不予赘述。

相应的，本发明公开了上述标记疫苗的构建方法，包括如下步骤：1)构建A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒；

2)以步骤1)为基础，构建缺失3A蛋白104-115编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA的重组质粒；

3)以步骤2)为基础，拯救缺失口蹄疫病毒3A蛋白104-115编码区的A型口蹄疫病毒，作为A型口蹄疫标记疫苗的种毒。