[发明专利]检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒，以及利用该试剂盒检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的方法。

(二)背景技术

糖原累积症Ⅰ型又称VonGierke病，简称GSDⅠ，是遗传性肝内葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)先天性缺乏而导致糖原分解或合成障碍的常染色体隐性遗传性疾病。G6Pase体系主要由4个组分组成：葡萄糖-6-磷酸酶-ɑ(G6PC)、葡萄糖-6-磷酸转运体(G6PT1)、无机磷酸盐转运体(T2)、葡萄糖转运体(T3)，分别行使葡萄糖-6-磷酸的水解，G6p的转位，磷酸的运输和葡萄糖运输的功能。根据缺陷的酶的不同将GSDⅠ分为4个亚型：G6PC缺陷引起GSDⅠa；G6PTI缺陷引起GSDⅠb；磷酸盐转运体缺陷引起GSDⅠc和葡萄糖转运体缺陷引起GSDⅠd。

研究表明，其中GSDⅠ型约占整个糖原累积症的25％，而Ⅰ型中Ⅰa型约占80％，故GSDⅠa型是一种相对较为常见的糖原代谢障碍疾病,其活产儿发病率约为十万分之一。临床表现主要为低血糖、肝脏肿大、高脂血症、高尿酸血症、高乳酸血症等，主要累及肝脏、肾脏和小肠，在临床上主要问题表现为诊断率低和诊断手段有限。控制GSDⅠa型的基因为G6PC，该基因定位于G6Pase基因位于人类的17号染色体长臂2区l带,全长12.5kb，包含5个外显子。G6PC蛋白为细胞内质网膜蛋白,包含357个氨基酸，为高度疏水性蛋白，有9个跨膜单位,其N端位于内质网腔内,C端位于质膜上。目前国内外学者对GSDⅠa型的基因型研究已确定了多种突变，包括错义突变、剪接突变、移码突变、缺失、基因与假基因融合与基因转化等，具有种族差异性，常见的突变位点为R83C、Q347、R83H、R83C、V338F、D38V、G68R、IVS3-58T>A、IVS4+10G>A。中国人GP6C基因突变等位基因中以R83H及R83C为最常见。

基因测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。目前常用的Sanger测序法是Frederick Sanger于1975年发明的，测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应(PCR)。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸又少了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。作为一种新型基因检测技术，基因测序能够从血液或唾液中分析测定目的基因序列，助力相关遗传病诊断，可以对那些即使没有临床症状的患者，也可以得到尽早的诊断和治疗，为临床诊治提供科学依据。与患者拥有相同基因型的家族成员，尽管没有临床症状也应该尽早治疗，而临床症状或生化检查都模棱两可的家族成员，有可能是杂合子携帯者需加以关注，具有高度特异且精确，低成本，操作简便，快速，高通量等优点，是国际上公认的检测基因突变的“金标准”。

在G6PC基因克隆之前，GSDⅠa的诊断主要靠临床表现和生化检查，确诊则需要肝穿刺检测肝标本中G6Pase的活性，对携带者无法进行检查，产前诊断如果对胎儿肝脏进行活检会给胎儿带来危险。G6PC基因突变检测使得以DNA为基础的基因诊断成为可能，该方法不仅显著提高了不典型GSDⅠa型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。同时对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，因而对于GSDⅠa型的基因测序检测，具有更准确、更经济、更简便，利于开展，避免了以往该病的诊断有赖于肝穿刺及活检的诊断方法，更易于被患者接受。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒及方法，用于检测G6PC基因突变位点，特异性好，灵敏度高。

本发明采用的技术方案是：

检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；

所述特异性引物序列如下：

外显子Exon1扩增引物：

上游引物：5’-AGCAATCACCACCAAGC-3’

下游引物：5’-TCCAAAGTCAGAGAGAGGG-3’；

外显子Exon2扩增引物：

上游引物：5’-TTCTCAGGCTACACTCTTC-3’

下游引物：5’-CGTGCCTCTCTGGAC-3’；

外显子Exon3扩增引物：