[发明专利]一种快速测定山羊乳腺上皮细胞脂肪酸成分的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物样品分析技术领域，具体涉及一种快速测定山羊乳腺上皮细胞脂肪酸成分的方法。

背景技术

乳腺是哺乳动物中少数可以重复经历生长，功能分化和退化过程的器官之一，也是动物转基因技术及乳腺生物反应器等研究的重要组织，因此明确乳腺的生物学功能具有重要意义。乳腺上皮细胞是乳腺组织的重要组成部分，对于研究乳腺的功能具有重要价值，已成为研究乳腺功能的重要靶细胞之一。通过测定细胞内脂肪酸成分的变化从而探讨细胞中脂代谢调控机制是现在研究乳腺的功能的重要手段，其生成的脂肪酸是乳中脂肪酸的重要来源，同时，细胞内脂肪酸成分也是细胞内重要的信号分子，通过测定细胞中脂肪酸的成分的变化来探讨脂肪酸在乳腺内脂质代谢调控网络中的作用具有重要意义。

然而，现在对于脂肪酸提取及测定的报道主要集中在组织及乳中，组织中脂肪酸的测定主要应用氯仿/甲醇/水系统，然而这种方法毒性较强，且过程较为繁琐，耗时较长。对于细胞中脂肪酸的提取及测定报道较少，所以获得一种适用于山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸成分的提取及测定分析方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的之一是为解决上述现有技术中存在的问题，提供一种适用于山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸成分的提取及测定分析方法。

本发明提供的一种快速测定山羊乳腺上皮细胞脂肪酸成分的方法，包括以下步骤：

A1：收集细胞

待细胞培养皿中细胞密度为90％以上时弃去细胞培养液，用PBS缓冲液清洗细胞，然后向所述细胞培养皿中添加一定量的硫酸/甲醇溶液，然后用细胞刮铲将细胞完全转移至预先加入一定量的硫酸/甲醇溶液的微量玻璃反应瓶中；所述细胞指山羊乳腺上皮细胞。用刮取的方法尽可能多的保留了样品内的脂肪酸成分，采用微量玻璃反应瓶则避免了酯化过程中的泄露情况的发生。

A2：甲酯化处理

将所述微量玻璃反应瓶盖拧紧密封，然后进行超声处理，超声处理后于水浴中放置一定时间，然后于室温下自然冷却。

A3：脂肪酸抽提

待冷却至室温后向所述微量玻璃反应瓶中加入1.5mL～2.5mL0.1M的HCl水溶液，并使用硅化枪头向微量玻璃反应瓶中加入800μL～1.5mL正己烷，然后涡旋震荡30s～1min震荡后离心。所述加入800～1.5mL正己烷用较小的容积尽量增大样品的浓度，同时避免了加入量过大时，后续浓缩过程中造成脂肪酸成分损失而影响测定结果。

A4：成分测定

使用硅化枪头取离心所得上清液并加入至装有无水Na₂SO₄的2mL硅化离心管中，然后震荡30s～1min后静置5～7min，静置后离心，吸取离心所得上清液并加入至玻璃进样瓶中用于GC-MS分析。

进一步的，上述步骤A1中，所述细胞培养皿的规格为60mm～100mm，所述一定量的硫酸/甲醇溶液是指500μL～1.5mL2.5％硫酸/甲醇溶液；所述2.5％硫酸/甲醇溶液指含硫酸体积百分比为2.5％的甲醇溶液。

进一步的，上述步骤A2中，所述超声处理的时间为10～20min，所述水浴指80℃水浴，所述一定时间为60min。

进一步的，上述步骤A3中，向所述微量玻璃反应瓶中加入2mL0.1M的HCl水溶液。

进一步的，上述步骤A3中，离心的条件为：3000r/min离心5min。

进一步的，上述GC-MS分析的条件如下：

载气：He；

载气流速：1mL/min；

进样口温度：240℃；

进样量：1μL；

分流比：1：10；

升温程序：40℃保持2min，然后以8℃/min升温至180℃并保持2min，然后以3℃/min升温至240℃并保持10min；

质谱溶剂延迟：5min；

电离能：70eV；

质量数范围：35～500amu。