[发明专利]遗传性视神经病变基因检测方法、基因芯片和试剂盒

权利要求书

1.一种遗传性视神经病变基因检测试剂盒，其特征在于，包括检测视神经病变基因SNP的多重PCR探针、引物对，所述探针具有如SEQ ID No：1-117所示的序列，所述引物对具有如SEQ ID No：118-133所示的序列。

2.一种用于检测遗传性视神经病变基因芯片，其特征在于，该芯片具有针对13个线粒体基因46个SNP位点的如SEQ ID No：1-117所示的序列。

3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照为人的GADPH基因和?-globin基因，其扩增引物序列以及对应探针如下所示，其中此两对引物与待检测的遗传性视神经病变基因：GADPH前向引物GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，GADPH反向引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT，GADPH探针序列GCCATCAATGACCCCTTCATT、GCCATCAATCACCCCTTCATT；?-globin前向引物GTGGATGAAGTT GGTGG TGAGG，?-globin反向引物CCAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGGA，?-globin探针序列CTGGACAAC CTCAAGGGCACC、CTGGACAAGCTCAAGGGCACC。

4.利用权利要求1所述的试剂盒及权利要求2或3所述的基因芯片进行遗传性视神经病变基因SNP位点的检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）标记样本扩增：将临床样中提取的DNA进行多重PCR扩增，在扩增当中引入Cy3-dCTP或者Cy5-dCTP，获得目的片段；

（2）杂交：将上述扩增得到的目的片段的DNA序列与基因芯片上分布的经过特殊碱基修饰的DNA探针进行杂交反应；

（3）扫描：采用芯片扫描仪对杂交信号进行扫描，根据GenePix 4000B的说明设定相关的光电倍增管、聚焦距离和扫描波长等对芯片进行扫描；

（4）芯片数据获得与处理：用扫描仪扫描芯片，获得杂交图谱，并通过Array-Pro分析软件获取每个检测杂交点的Cy3和Cy5荧光信号强度和标准误，数据经过背景噪音减除后获得其真实杂交信号值，根据杂交信号数值强弱判断SNP位点；

（5）结果判读：将芯片的扫描后的原始图像信息转变为数字信息，根据数字信号判读视觉病变基因的SNP位点信息。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，样本标记的多重PCR反应的具体处理方式如下：

（1）以如下体系配制反应体系：5 X Phusion Buffer ：5uL、Template(50ng/uL)                                 1 uL，Primer Mix(19 uM) 1 uL，10 mMdNTP Mix (Cy3-dCTP: dCTP=1:10) 0.5 uL，2 U/uL的 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 uL，去离子水17.25 uL，总量为 25 uL；

（2）扩增PCR的条件为：

（3）纯化PCR产物的操作流程：

1) 室温避光平衡Ampure beads 30min，将25uLPCR产物转移至1.5 ml 离心管中，加入 25uLAmpure beads吹打10次混匀，室温放置5min，

2）将上述离心管置于磁力架5min，至液体澄清为止，

3）取上清转移至另一1.5 ml 离心管中，

4）在上清中加入Size slector beads 5ul 吹打10次混匀，室温放置5min，

5）将上述离心管置于磁力架5min，至液体澄清为止，弃上清，

6）将离心管留在磁力架上加入 200uL新鲜配置80%乙醇，30s后弃上清，

7）再次加入200uL新鲜配置80%乙醇，30s后弃上清，将离心管留在磁力架上，室温干燥5-10min，

8）加入16 uL 10mM Tris，吹打10次混匀，室温放置2min，将离心管置于磁力架5min，至液体澄清为止，吸取15uL上清进行nanodrop定量，95oC 变性10分钟，冰上放置，待用。