[发明专利]一种用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌23S-5S rRNA基因测序鉴定法的引物序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌23S-5SrRNA基因测序鉴定法 的引物序列。

背景技术

病原菌的鉴定方法多种多样，目前较为广泛应用的仍然是以生化反应为基础的仪 器分析鉴定，但某些情况下并不十分精准。随着分子生物学技术的兴起，使得在分子水平上 鉴别细菌的方法更为深入与准确，测序法则是其中之一。原核生物rRNA基因5’端至3’端依 次为：5’-16S(1540bp)-ITS1-23S(2900bp)-ITS2(70bp)-5S(120bp)-3’。其中，16S rRNA因其含有较多的变异区和保守区，且分子大小适宜，其序列分析作为微生物系统分类 的主要依据已得到了广泛的应用，技术已较为成熟，数据库已较为完善，但对于相近种及种 内株间的区分力度尚缺。16S-23SrRNA因其较快的进化速度被应用于16SrRNA无法鉴别 的关系密切的菌种或种内株间的鉴别，是前者很好补充。虽然如此，某些细菌如金黄色葡萄 球菌、大肠埃希菌等，其16S-23SrDNA间区比较复杂，不同拷贝之间大小、序列比较相近，测 序结果不易解释。23SrRNA分子大，目前为止只有少数菌的序列被报道，数据库很不完善， 且不同细菌种属中该片段的变异性不同，因此在细菌分类和鉴定中未能广泛应用。5SrRNA 曾被用于环境中微生物的鉴定，但因片段小，携带遗传信息量小，同样，在微生物分析鉴定 中也未被广泛采用。23S-5S区间序列由于序列更短，目前为止，国内外对23S-5S区间序列在 鉴定微生物方面的研究报导寥寥可数，几近空白。本研究针对两种菌的23S后段-ITS2-5S序 列各自设计引物，建立了将荧光PCR技术和产物直接测序相结合的方法，得到它们23S后段- ITS2-5S片段并进行序列分析，再将序列提交到NCBI网站进行nucleotideblast比较，获取 相似性最高的匹配菌种以确定其分型结果。实验证明，23S-5S序列作为遗传标记用于鉴定 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌准确可靠。

发明内容

本发明的目的在于公开一种可用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌病原

菌鉴定的23S-5SrRNA基因测序鉴定法的引物序列。

一种用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌23S-5SrRNA基因测序鉴定法的引物序 列。使用该序列可测定23S-5SrRNA中部分特征性基因片段，用于准确鉴定大肠埃希菌和金 黄色葡萄球菌。

下表为表1，为用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌23S-5SrRNA基因测序鉴定法的 引物序列

基于上述目的，本发明采用以下具体实施方案：

采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测 序。

基于本发明研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：

1）FTA卡1片。

2）PCR反应液1管，内装SYBRGREEN荧光PCR反应液，包括Taq酶、dNTP、含Mg²⁺的 Buffer、SYBRGREEN溶液。

3）上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物。

4）双脱氧测序试剂一套，包括BigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5 ×),BigDyeMix。

5）测序产物纯化试剂一套，包括XTerminatorsolution、SAMsolution各1管。

6）去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水。

基于本发明建立的基于荧光PCR的快速测序方法，按下列步骤进行：

1）FTA样品卡的制备

细菌悬液经适当稀释后（大约6×10⁴至6×10⁷CFU/mL），吸取100ul滴于FTA卡上，室 温晾干备用。

2）SYBRGreen实时荧光PCR直接扩增目标片段