[发明专利]一种用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌23S-5S rRNA基因测序鉴定法的引物序列

权利要求书

1.一种用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌23S-5SrRNA基因测序鉴定法的引物序列， 其特征在于所述的引物序列包括：

。

2.一种用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌23S-5SrRNA基因测序鉴定法，采用FTA卡核 酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序，基于本发明研 制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：

1）FTA卡1片;

2）PCR反应液1管，内装SYBRGREEN荧光PCR反应液，包括Taq酶、dNTP、含Mg²⁺的Buffer、 SYBRGREEN溶液;

上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物;

双脱氧测序试剂一套，包括BigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×), BigDyeMix;

测序产物纯化试剂一套，包括XTerminatorsolution、SAMsolution各1管;

去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水;

基于本发明建立的基于荧光PCR的快速测序方法，按下列步骤进行：

1）FTA样品卡的制备

细菌悬液经适当稀释后（大约6×10⁴至6×10⁷CFU/mL），吸取100ul滴于FTA卡上，室温 晾干备用；

2）SYBRGreen实时荧光PCR直接扩增目标片段

配制反应体系：按常规配制SYBRGreen实时荧光PCR反应体系，加入上下游引物的终浓 度均为100ng/uL，用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片加入体系，终体积为20uL；

荧光PCR直接扩增：使用荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为，95℃2min，[95℃ 10s，51℃20S，72℃40S(荧光采集)]35次循环，72℃10min；

PCR扩增效果评价：荧光PCR产物合格的标准为Cp值小于30且熔解曲线显示只有一个明 显主峰，否则即为扩增产物不合格；

3）测序PCR反应

如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5-10倍，取已稀释的产物1ul 置于PCR管中，再加4ulBigDyeTerminatorv3.1SequencingBuffer(5×),测序引物 （上游或下游引物）的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增；

扩增条件为：98℃2min，（96℃10S，50℃5s，60℃4min）25次循环；

4）产物纯化、毛细管电泳和序列读取、分析和比对在96孔板中加入产物1uL，SAM solution9uL，BigDyeXTerminatorsolution2uL；

震荡5min，2000g离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电 泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列；

测序结果使用NCBI网站上的“nucleotideblast”功能进行序列比对，数据库选用 “Nucleotidecollection(nr/nt)”，选取比对结果匹配率最高的一项（一般为首项）作为 最终的分型结果。