[发明专利]一种酯酶拆分(±)‑扁桃酸甲酯的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法。

背景技术：

扁桃酸及其衍生物的对映体是一类非常重要的药物中间体，被广泛应用于多种药物的合成，如青霉素、头孢菌素、环扁桃酯、抗肿瘤制剂、辅酶A等。光学纯扁桃酸系列化合物传统制备工艺为化学合成外消旋产物后再进行手性化学拆分，此方法试剂昂贵，污染环境，且纯度不高。生物催化法制备手性化合物是一类集生物技术与化学工程于一体的新兴方法，该方法具有效率高、选择性强、环境友好等优点，是近年来科研人员研究的重点和热点。其中，生物催化法制备光学纯扁桃酸系列化合物基于所涉及催化剂种类的不同又可以细分为3种：1)依赖于氧化还原酶体系催化法，2)腈水解酶催化法，3)酯酶/脂肪酶催化法。Tsuchiya等利用氧化还原酶体系将外消旋的扁桃酸转化成单一异构体的R-扁桃酸，产率达到75％，对映体过量值大于99％。李忠琴等人利用酵母菌的突变株转化苯乙酮和苯乙酮酸甲酯得到相应的R构型酸和酯，产率大于90％，对映体过量值均大于99％。其次，Yamamoto和Banerjee等人分别利用腈水解酶催化外消旋扁桃腈，均获得较高的产率和对映体过量值的R-扁桃酸。再有，Kim等人利用Pseudomonas sp.细胞拆分(±)-扁桃酸，获得对映体过量值为99.4％的R-扁桃酸。这些例子均体现生物催化法具有转化效率高、立体选择性强的特点。其中，酯酶/脂肪酶是一类酯键水解酶，它可在油水界面催化长链甘油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸；而它在非水介质中又能催化酸的羧基与醇的羟基进行脱水缩合反应产生酯类化合物，如此独特的性质使其在多种反应(水解反应、酯化反应、醇解反应、酸解反应等)中具有广泛的应用，并且备受关注。

然而，目前报道的这些酶类大部分是优先作用R构型，通过水解或者转化得到R-扁桃酸，因此，有必要寻找和开发优先作用S构型的酶类，以制备S-扁桃酸和R构型的扁桃酸系列化合物，进而研究相应的作用机理。

发明内容：

本发明的目的是提供一种酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，利用该方法能够拆分(±)-扁桃酸甲酯制备R-扁桃酸甲酯，其具有操作简单，对环境友好，耗时少，产物得率高，单一对映体光学纯度高的优点。

本发明的酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在酯酶EST04211存在的情况下，对(±)-扁桃酸甲酯进行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后再将R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸进行分离，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法，具体步骤优选如下：

称取(±)-扁桃酸甲酯加入到反应器中，再加入pH为6～10的反应缓冲液和酯酶EST04211形成反应体系，在30～40℃下，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后用疏水性溶剂进行萃取，从疏水性溶剂中得到R-扁桃酸甲酯。按照此方法进行拆分，R-扁桃酸甲酯的对映体过量值为>90％，最高达到99.9％以上，产率最高接近90％。

进一步优选，在反应体系中，反应缓冲液的pH值为6～7，(±)-扁桃酸甲酯的初始反应浓度为5～40mM，酯酶EST04211用量为20μg/ml，反应时间为1～2小时。

所述的疏水性溶剂优选为乙酸乙酯。

本发明还提供了酯酶EST04211在拆分(±)-扁桃酸甲酯获得R-扁桃酸甲酯中的应用，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的(±)-扁桃酸甲酯是指R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸甲酯的混合物。

本发明与传统的化学拆分相比，具有反应条件温和、无污染、对映体过量值高的优点；与目前报道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211优先水解S构型的扁桃酸甲酯得到光学纯的R-扁桃酸甲酯，立体选择性强。所得产品可以简单加以纯化后用于相应药物的合成。

附图说明：

图1是酯酶EST04211催化(±)-扁桃酸甲酯水解的过程方程式；