[发明专利]一种黄曲霉毒素B1的制备方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种黄曲霉毒素，具体地说，涉及一种黄曲霉毒素B1（AFB1）的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

霉菌毒素（mycotoxin）是霉菌产生的次级代谢产物，广泛污染农作物、食品及饲料等植物源性产品。霉菌毒素可以引起人类和动物的急性或慢性中毒，可损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，更为严重的是，部分真菌毒素已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。其中，AFB1被认为是目前致癌力最强的天然物质，其毒性是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍。2014年5月在北京召开的“2014年国际真菌毒素大会”上，来自农产品安全领域的专家学者报道，肉眼看不见的真菌毒素，比显性的霉变要量大面广得多，而且具有隐蔽性强、潜伏期长的特性，霉菌毒素对食品安全的威胁要远远大于公众关注的农药残留超标、有害添加剂污染等；在我国食品安全监管的执行层面，真菌毒素防控仅仅处于起步阶段。全世界每年由于霉变、污染霉菌毒素引起的农产品和工业原料的直接损失达数百亿美元。目前为止，我国在2011年新修订《食品中真菌毒素限量》国家标准（GB2761-2011），专家呼吁把真菌毒素防控当作食品安全监管的重中之重，已经刻不容缓。

黄曲霉毒素AFB1是一类化学结构类似的化合物，主要结构为二氢呋喃环和香豆素。AFB1分子式为C17H12O6。在紫外线下AFB1发蓝色荧光，难溶于水易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚己烷和乙醚中。一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解。在pH9-10的强碱溶液中分解迅速，其纯品为无色结晶，耐高温，AFB1的分解温度为268℃，结构式如下：

世界各国都制定了严格的霉菌毒素限量标准，然而，黄曲霉毒素的污染不可避免，受地域、气候、种植作物、储存条件等一系列因素的影响，霉菌毒素的特性使其防控成为世界性的难题。虽然黄曲霉毒素有巨大毒性，但因为对其研究的广泛性和不断深入性，以及产量较低，各国相关研究机构、政府监管部门和第三方检测市场对黄曲霉毒素标准品有广泛的需求，造成黄曲霉毒素的价格是黄金的几十倍。由于黄曲霉毒素为二次代谢产物，毒性很大，产量少，对PH、温度等条件要求严格，在生产过程中收率非常低，严重制约产品商品化生产。目前，真菌毒素标准品的生产和市场主要掌握在国外大型生物公司，在国内因起步较晚，受培养条件和检测手段的制约，未形成商品化工艺。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种黄曲霉毒素B1的制备方法，采用该制备方法后，实现以下目的：

1）通过变温培养，提高了真菌毒素产量，达到0.53%（按蔗糖用量计算）。

2）提取方法简单，采用含有甲酸的乙酸乙酯、乙腈混合提取液，提取彻底并稳定。

3）工艺条件要求低、生产过程可控，工艺操作更安全，适于商品化生产。

4）培养基成分比较简单，原料易得，有利于AFB1的提取纯化，减少净化成本。

5）纯度高，达到98.0%以上。

6）重复使用减压浓缩的溶剂，原料使用和回收成本低。

为解决以上问题，本发明采用以下技术方案：一种黄曲霉毒素B1的制备方法，其特征在于：将接种培养后的菌种3.6156置于发酵培养基中进行培养，再用提取液提取AFB1，然后将含有AFB1的提取液减压浓缩，所得浓缩液经处理后得黄曲霉毒素B1。

一种优化方案，所述制备方法包括发酵培养基的制备步骤：

发酵培养基包括花生壳、花生渣、蔗糖、麸皮、尿素和水，先将尿素和蔗糖溶解在水中，然后加入花生壳、花生渣和麸皮，搅拌均匀，高温高压灭菌。

进一步地，所述制备方法还包括接种培养步骤：

取4℃保藏的菌种3.6156放置至室温，无菌接种到PDA液体培养基；

将接种后的PDA培养基放置到摇床培养，温度控制在30℃，转速160转/分钟，培养时间3天。

进一步地，所述制备方法还包括发酵接种步骤：

将接种培养后的菌种全部转移到发酵培养基，搅拌均匀。

进一步地，所述制备方法还包括AFB1毒素培养步骤：

将含有菌种的发酵培养基放置在霉菌培养箱，在30℃下培养3天，降低温度到26℃培养3天，再降低温度到22℃继续培养10天。

进一步地，所述制备方法还包括灭菌步骤：

将经AFB1毒素培养步骤后的发酵培养基经100℃高压灭菌30min。

进一步地，所述制备方法还包括提取步骤：