[发明专利]一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于罗汉果叶片蛋白质提取领域，特别是一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法。

背景技术

罗汉果(Siraidia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)的雌雄异株植物，具有重要的医疗和保健价值。罗汉果果实营养价值高，含有丰富的果糖、葡萄糖、蛋白质和多种维生素，其性凉味甘，具有清热解毒、止咳润肺等功效，已广泛应用于医药、饮料和调味品中。罗汉果甜甙甜度高、热量低、无毒，可作为肥胖病人、糖尿病人、高血压病人理想的食品添加剂。在历届《中国药典》中均有记载，具有清热润肺、滑肠通便的功效，用于治疗肺火燥咳。现代药理研究，其药理有效成分主要是罗汉果皂苷。目前，罗汉果优良品种稀少、种性退化、混杂严重、产量低、品质差。迄今为止，国内对罗汉果的研究主要集中在选育品种方面，对于罗汉果的发育机理研究较少，植株的蛋白质有效成分研究尚未见报道。

由于罗汉果植物叶片本身蛋白含量低，且常含有大量色素、酚类、有机酸、脂类及其他次生代谢产物，蛋白质提取有一定的难度，获得的蛋白质样品溶液粘稠，因为蛋白质样品中含有大量的多糖类物质，在使用丙酮等有机溶剂沉淀蛋白的同时，多糖类物质也沉淀下来。多糖类物质可溶于水，从而导致蛋白质样品溶液粘稠并影响蛋白质的溶解，进而影响了蛋白质样品的上样量和电泳的质量。传统方法主要采用酚法进行了植物叶片蛋白质提取，利用多糖类物质不溶于酚相这一特征，可使用饱和酚萃取蛋白，从而除去样品中的多糖类及其他不溶于酚的物质，但酚法无法有效去除多酚类和盐类物质。因此，酚法提取得到的罗汉果叶片蛋白质质量不佳，无法用于下一步蛋白质 组学分离，进而无法进行蛋白质组学分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，解决传统的酚提取法提取植物叶片蛋白质产生时无法有效去除多酚类和盐类物质的问题，实现了罗汉果叶片总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于蛋白质组学分析，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是通过采用微波装置进行微波处理，工艺简单，节能、污染小，进一步提高了蛋白质提取效率。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，

将预处理得到的罗汉果叶片粉末与第一蛋白质提取液混合，于-20℃中静置10-14h，4℃下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第一沉淀，其中，所述第一蛋白质提取液的加入量为每1g罗汉果叶片粉末添加2-4ml；

所述第一蛋白质提取液的制备方法为：将丙酮与β-巯基乙醇按体积比10000∶5-10混合，加入三氯醋酸，混合，于-20℃保存备用，其中，所述三氯醋酸的加入量为每1ml丙酮需1-1.05g。

优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括：

将所述第一沉淀与第二蛋白质提取液混合，每隔10min振荡一次，振荡至重悬，置于-20℃放置1-3h，于4℃离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第二沉淀，其中所述第二蛋白质提取液的加入量为每1g第一沉淀添加200-250μL；

所述第二蛋白质提取液的制备方法为：将丙酮与β-巯基乙醇按体积比为10000∶6-10混合，于-20℃保存备用。

优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括：

将所述第二沉淀与第三蛋白质提取液混合，振荡至重悬2-3次，于4℃ 离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第三沉淀，其中，所述第三蛋白质提取液的加入量为每1g第二沉淀添加200-250μL；

其中，所述第三蛋白质提取液的制备方法为：将丙酮、双蒸水以及β-巯基乙醇按体积比8000∶2000∶5-10混合，于-20℃保存备用。

优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，所述预处理是指将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯吡咯烷酮，研磨，得罗汉果叶片粉末。

优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括：

S1：将所述第三沉淀冷冻干燥至粉末状，于-20℃保存备用；