[发明专利]一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法

权利要求书

1.一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，其特征在于，

将预处理得到的罗汉果叶片粉末经过预处理后与第一蛋白质提取液混合，于-20℃中静置10-14h，4℃下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第一沉淀，其中，所述第一蛋白质提取液的加入量为每1g罗汉果叶片粉末添加2-4ml；

所述第一蛋白质提取液的制备方法为：将丙酮与β-巯基乙醇按体积比10000∶5-10混合，加入三氯醋酸，混合，于-20℃保存备用，其中，所述三氯醋酸的加入量为每1ml丙酮需1-1.05g。

2.如权利要求1所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，其特征在于，还包括：

将所述第一沉淀与第二蛋白质提取液混合，每隔10min振荡一次，振荡至重悬，置于-20℃放置1-3h，于4℃离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第二沉淀，其中所述第二蛋白质提取液的加入量为每1g第一沉淀添加200-250μL；

所述第二蛋白质提取液的制备方法为：将丙酮与β-巯基乙醇按体积比为10000∶6-10混合，于-20℃保存备用。

3.如权利要求2所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，其特征在于，还包括：

将所述第二沉淀与第三蛋白质提取液混合，振荡至重悬2-3次，于4℃离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第三沉淀，其中，所述第三蛋白质提取液的加入量为每1g第二沉淀添加200-250μL；

其中，所述第三蛋白质提取液的制备方法为：将丙酮、双蒸水以及β-巯基乙醇按体积比8000∶2000∶5-10混合，于-20℃保存备用。

4.如权利要求3所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，其特征在于，所述预处理是指将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯吡咯烷酮，研磨，得罗汉果叶片粉末。

5.如权利要求4所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，其特征在于，还包括：

S1：将所述第三沉淀经冷冻干燥后粉碎得到第三沉淀粉末，于-20℃保存备用；

S2：将所述步骤S1得到的第三沉淀粉末与蛋白质裂解液混合，于4℃裂解11-13h，得罗汉果叶片裂解溶液，其中，所述蛋白质裂解液的加入量为每1g所述第三沉淀粉末添加1ml；

所述蛋白质裂解液的制备方法为：按质量比96∶30-31∶6-9∶1-2将尿素、硫脲、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐以及二硫苏糖醇混合均匀，加入双蒸水，于-20℃保存备用，所述双蒸水的加入量为每0.48g尿素需1ml；

S3：将所述罗汉果叶片裂解溶液于4℃离心28-32min，转速为12000r/min，取上层清液，即得罗汉果叶片总蛋白质。

6.如权利要求5所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中，在冷冻干燥之前将所述第三沉淀与质量分数为8％的氯化钠溶液按照质量比1∶4混合，置于微波装置微波35s，微波功率为450w。

7.如权利要求6所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，其特征在于，所述预处理时，将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1∶18混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为20MPa，萃取温度为30℃-33℃，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1∶100混合，搅拌10min，加入摩尔浓度为0.4-0.6mol/L的碳酸氢钠溶液直至pH值为9.2-9.6，22℃下静置3h，清水洗至pH值为6.8-7.1，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末。