[发明专利]用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各种癌症之首。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万，肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。（Orras JM,Fernandez E,Gonzalez  JR, et  al.Lung  cancer  mortality  in European regions(1955-1997).Ann  Oncol,2003,14(1):159-161;中华人民共和国卫生部，《2010年中国卫生统计》年鉴）。

肺癌从组织病理学上可以分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（non-small  cell lung cancer ,NSCLC）两大类，其中非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85%。在我国肺癌患者5年生存率仅为13%，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相配的科学治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。

目前化疗仍是肺癌的主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。RET基因为原癌基因，定位于第10号外显子的q11.2位置，编码一个受体酪氨酸激酶。研究发现，RET基因在乳头状甲状腺癌和非小细胞肺癌中还可以和CCDC6，NCOA4，PRKAR1A，TRIM24, GOLGA5, TRIM33, KTN1, ERC1, MBD1 和 TRIM27发生融合，激活下游RAS/MAPK/ERK, PI3K/AKT, 和 phospholipase C?信号途径，引起癌症的发生（Gainor JF，Shaw AT， The Oncologist2013;18:865–875 ）。

以卡博替尼、凡德他尼为代表的药物是针对RET基因融合突变开发的小分子靶向药物，通过抑制RET酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明卡博替尼对RET融合突变患者的有效率可达61%以上，而对野生型的患者几乎没有疗效。因此，检测RET融合突变情况是指导卡博替尼类药物用药的前提和基础，在治疗之前通过高敏度的检测方法检测RET融合基因突变对于提高患者的生存率，延长生存期，提高生存质量有着重要意义。

目前，RET融合突变的检测方法主要为荧光原位杂交（FISH）法，然而FISH法检测特异性差，灵敏度低，检测时间长。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存时间不宜过长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因此，FISH检测法无法满足临床医生检测实际应用的需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度的可以同时检测RET多种基因融合的检测方法，以实现快速对RET多种融合突变进行同时检测，从而为临床肺癌个体化治疗方案提供科学参考依据。

发明内容

本发明的目的：提供一种用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒，可以一次同时检测RET基因的17种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种用于RET融合基因检测的引物、探针，包括RET融合突变特异性反转录引物及RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的RET融合突变特异性反转录引物具体为：

RET反转录1：    TGAAGGAGAAGAGGACAGCG            SEQ ID NO：01

RET反转录2：    CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC          SEQ ID NO：02

RET反转录3：    CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG          SEQ ID NO：03

Actin反转录4：   CAGGAGGAGCAATGATCTTG           SEQ ID NO：04。