[发明专利]一株近平滑假丝酵母重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法

说明书

技术领域

一株近平滑假丝酵母重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法，构建(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中的表达质粒，实现(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中的原位表达，高效制备(S)-苯基乙二醇的方法，本发明涉及基因工程手段构建(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母的重组菌，高效制备(S)-苯基乙二醇的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

手性化合物在医药、农药、激素、食品添加剂等精细化工领域应用广泛，如光学纯苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，而且是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。

氧化还原酶催化的不对称还原反应常用于手性化合物的制备。目前常用的氧化还原酶大部分来源于重组大肠杆菌。然而在大肠杆菌中重组表达后的氧化还原酶功能由于缺乏后期的蛋白后修饰，催化转化手性化合物的效率不尽如人意。

本实验室前期已经利用(S)-羰基还原酶II的大肠杆菌重组菌催化不对称转化制备(S)-苯基乙二醇。(S)-羰基还原酶II在大肠杆菌中异源表达后，利用大肠杆菌全细胞不对称转化2-羟基苯乙酮，获得的(S)-苯基乙二醇的光学纯度和得率分别只有89.1%和82.6%。在此基础上，从近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)基因组中调取目的基因scrII，同时构建近平滑假丝酵母中的表达质粒pCP，在原有的(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中本底表达的水平上，通过同源重组将目的基因scrII整合入近平滑假丝酵母基因组，增强了(S)-羰基还原酶II的催化功能。通过优化生物转化反应条件，近平滑假丝酵母重组菌株催化底物2-羟基苯乙酮，产物(S)-苯基乙二醇光学纯度和产率均达到99.9%。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明目的在于根据已经获得的近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) (S)-羰基还原酶II基因scrII (GenBank accession No.GQ411433)，通过将scrII整合入近平滑假丝酵母基因组，构建(S)-羰基还原酶II的近平滑假丝酵母重组菌株。利用该重组菌催化2-羟基苯乙酮高效制备具有光学活性的(S)-苯基乙二醇，该重组菌不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学活性(S)-苯基乙二醇，产物的光学纯度和产率高达99.9%，为利用新型重组酵母菌株高效制备手性化合物提供了有效途径。

（2）技术方案

一株不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的原位表达(S)-羰基还原酶II的近平滑假丝酵母重组菌，其分类命名为近平滑假丝酵母菌/(S)-羰基还原酶II（C parapsilosis pCP-scrII），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015107。

一、基因组的获得

野生型近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011生长培养基YPD组成质量百分为：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。将近平滑假丝酵母菌接种于培养基装液量为30% 的250 mL摇瓶中于28℃、200 r/min振荡培养16-18 h。培养结束后，将菌体于12,000 r/min离心5 min，用生理盐水洗涤两次后收集细胞。利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Mini Preparation Kit（Takara公司）提取基因组。

二、scr II基因的调取

从近平滑假丝酵母中调取目的基因的同时，将目的基因中酶切位点Kpn I序列（GGTACC）同义突变为GGCACA。

以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Sac I和Kpn I限制性酶切位点的引物SCRII_Sac I_F1和SCRII_Kpn I_R1，以及Kpn I突变点引物Mut_Kpn I_F2和Mut_Kpn I_R2：

合成两端引物：