[发明专利]一种检测血液循环肿瘤细胞的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应法进行上皮细胞粘附分子表达检测，以得到上皮粘附分子表达水平，以及该测试方法在检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞水平的应用。

背景技术

目前对肺癌患者循环肿瘤细胞的检测多采用免疫磁珠分选法,该方法虽有较高的准确性,但灵敏度不足，面对越来越少样本量的限制,该方法已不足以进行大量肿瘤患者疾病筛选及多次术后疗效评估。

EpCAM(上皮细胞粘附分子)于1979年由Herlyn等^[1]在结肠癌中发现,被认为是人类结肠癌组织的主要肿瘤相关抗原。EpCAM不同程度地表达于所有的正常上皮和上皮源性恶性肿瘤中,且多位于细胞间紧密连接处。在结缔组织及造血系统来源的细胞、脑组织和血管内皮细胞中缺乏明显的EpCAM的表达。因此，EpCAM可作为用于检测非小细胞肺癌CTCs的组织特异性表达标志物，并可以通过QRT-PCR等非常敏感的定量检测方法可对其表达进行检测。

上皮特异性细胞粘附分子EpCAM是最早以单克隆抗体技术鉴定出的肿瘤相关抗原之一。它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导钙非依赖性细胞间同型黏附功能，据此可归入粘附分子家族。

相关的研究提示EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与包括细胞与基质的相互作用、迁移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种过程。同时，EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达，提示其与肿瘤生长增殖等具有密切相关。多项研究已证实EpCAM的表达与乳腺癌和结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关。

EpCAM在上皮来源的组织中广泛表达(单层上皮，假复层上皮，移行上皮)，定位于细胞基底外侧膜。一般鳞状上皮不表达，部分上皮来源的腺上皮细胞如肝细胞，上皮角化细胞、胃壁细胞、肌上皮细胞和胸腺皮层上皮亦不表达。间叶组织、肌肉和神经内分泌组织也不表达EpCAM。此外，淋巴样来源的细胞EpCAM也呈阴性表达。不同的组织类型EpCAM的表达水平存在差异。如在胃肠道，胃上皮呈阴性或极弱表达，小肠粘膜相对高表达，结肠在已知EpCAM阳性的细胞中表达水平最高。

大部分粘附分子在细胞发生恶性转化期间和其后都发生表达的改变，或上调，或下调或原位表达，EpCAM也不例外。在大部分上皮来源的肿瘤中EpCAM都呈高表达。在间质或外胚层来源的肿瘤如神经原性肿瘤，肉瘤，黑色素瘤或淋巴瘤等，EpCAM不表达。

经研究证实,实体瘤患者的外周血中存在肿瘤细胞，CTCs的存在是肿瘤转移必需的，因此研究者可把CTCs作为未来正式的一种预后标志物。另外,它也是实体瘤的先锋,被认为是一种有效的抗肿瘤药物的新靶标。

EpCAM(上皮细胞粘附分子，非小细胞肺癌CTCs，外周血循环肿瘤细胞水平。

发明内容

本发明的目的是利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应法对肺癌患者外周血进行上皮细胞粘附分子表达检测，以反映体内循环肿瘤细胞水平。

为了实现本发明的目的，提出以下技术方案：

一种荧光定量聚合酶链式反应检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，该方法利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应进行上皮细胞粘附分子表达检测，得到上皮粘附分子表达水平，用以检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞，其特征在于，所述上皮细胞粘附分子表达检测流程包括以下步骤：

1)在非小细胞肺癌患者肘正中静脉处采取外周血液2mL，将血液保存于EDTA抗凝血管中，并放置在4℃冰箱内存储；

2)以300G离心10分钟，弃去上层血浆，保留血细胞层；

3)利用红细胞裂解液去除血细胞中的红细胞，保留其中有核细胞，在-80℃冰箱中保存；

4)将经上述处理的样本加入Trizol液提取总RNA；

5)将总RNA经过逆转录反应得到相应的cDNA样本；

6)制备EpCAM，利用Qrt-PCR绝对定量法进行EpCAM表达水平检测，并以健康志愿者标本为阴性对照。

在步骤4中，提取总RNA的过程如下：

4.1)匀浆化作用，取出约50～100mg步骤3中处理后的样本,放入10ml的无酶玻璃匀装管中,加入1ml的Trizol液,在电动匀漿器充分匀浆；

4.2)分离阶段，把匀浆液转移至5ml的无酶离心管,室温放置5min,然后加入0.2ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15s；

4.3)再次离心，室温放置5min,放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃离心30min；