[发明专利]一种检测血液循环肿瘤细胞的试剂盒

权利要求书

1.一种荧光定量聚合酶链式反应检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法， 该方法利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应进行上皮细胞粘附分子表达检测，得到上皮粘附分子表达水平，用以检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞，其特征在于，所述上皮细胞粘附分子表达检测流程包括以下步骤：

1）在非小细胞肺癌患者肘正中静脉处采取外周血液2mL，将血液保存于EDTA抗凝血管中，并放置在4℃冰箱内存储；

2）以300G离心10分钟，弃去上层血浆，保留血细胞层；

3）利用红细胞裂解液去除血细胞中的红细胞，保留其中有核细胞，在-80℃冰箱中保存；

4）将经上述处理的样本加入Trizol液提取总RNA；

5）将总RNA经过逆转录反应得到相应的cDNA样本；

6）制备EpCAM，利用Qrt-PCR绝对定量法进行EpCAM表达水平检测，并以健康志愿者标本为阴性对照。

2.根据权利要求1所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤4中，提取总RNA的过程如下：

4.1）匀浆化作用，取出约50～100mg步骤3中处理后的样本,放入10ml的无酶玻璃匀装管中,加入1ml的Trizol液,在电动匀漿器充分匀浆；

4.2）分离阶段，把匀浆液转移至5ml的无酶离心管,室温放置5 min,然后加入0.2ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15s；

4.3）再次离心，室温放置5min,放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃离心30min；

4.4）RNA的沉淀，取上层水相转移至一新的无酶离心管,加入等量异丙醇,室温放置l0min,再次放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃,离心10min；

4.5）RNA的洗脱，倒掉上清,留取底部沉淀,加入1ml现配的预冷好的75%的无酶乙醇，所述配比为DEPC水:无水酒精=1 :3，振荡洗漆RNA沉淀一次,然后放入4℃预冷的离心机,7500rpm,4℃,离心5min；

4.6）RNA的再溶解，倒掉上清,取沉淀置于超净工作台,室温下自然风干5min,此时RNA沉淀变透明,再在管中加入20ul DEPC水，50℃水浴l0min，充分溶解,将所提取的总RNA保存于-80℃冰箱备用。

3.根据权利要求2所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤5中，cDNA的合成包括步骤：

5.1)在冰上准备0.5ml无酶PCR反应管并建立逆转录反应体系12ul，其中，总RNA 3ul；Oligo dT 18 primer lul；DEPC treated water 8ul；

将以上混合物以6000rpm，41℃，离心5sec,旋转混匀，按以下反应条件进行第一步逆转录反应：65℃，5min，再以4℃存10min；

5.2)继续在冰上依次加入5Xreaction buffer 4ul，Ribolock  RNAse Inhibitor lul，RevertAid M-Reverse Transcriptase lul，dNTP mixture 2ul，总反应体系20ul；

将以上共20ul的混合离心5sec，液旋转混勾,按以下反应条件进行第二步逆转录反应:42℃，60min，70℃，5min；再以4℃存10min，合成的cDNA存放在-2℃的冰箱储存备用；

5.3)使用逆转录试剂盒中提供的1.1Kb RNA进行逆转录反应,监测反应体系；

5.4)质量检测:采用试剂盒里提供的485bp的管家基因GAPDH引物对获得的cDNA进行PCR扩增。

4.根据权利要求3所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤5.4）中，cDNA进行PCR扩增包括步骤：

5.4.1）在冰上建立以下反应体系25ul，包括普通PCR reaction mixture 12.5ul，GAPDH的上、下游引物各lul，cDNA模板lul，加无菌去离子水至25ul；

5.4.2）反应条件：预变性94℃ 3min，变性94℃ 45s,退火55℃ 30s,延伸72℃:45s，共30个循环，终延伸5min；

5.4.3）将PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,120V恒压电泳30min。