[发明专利]ssDNA次级文库的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学与临床医学技术领域。具体而言，本发明涉及ssDNA次级文库的制备方法。

背景技术

核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选而获得的单链DNA或RNA，它是一种新型的核酸分子探针，通过折叠可形成特定的三维结构，能与生物靶分子结合。核酸适配体具有分子量小、可人工合成、稳定性好、无毒性等优点，近年来核酸适配体的筛选得到迅速发展，在疾病基础研究及诊断治疗中具有广泛的应用价值。

核酸适配体筛选技术是核酸适配体生物医学应用的前提和基础，虽然目前已有多种筛选方法，但均存在不足。PCR扩增是Aptamer筛选的关键技术，但随着PCR扩增循环数的增加，大量的序列基序（sequence motifs）通过非特异性杂交产生大量的副产品，这些副产品会干扰Aptamer的筛选，并导致筛选失败。所以PCR扩增产物均需纯化，以便获得单一的ssDNA成分，但现有的纯化技术会导致目标分子的大量丢失。目前主要用于ssDNA 文库制备的方法主要有三种：不对称PCR法（asymmetric PCR）、生物素-链霉亲和素分离法（biotin-streptavidin separation）及核酸外切酶消化法（exonuclease digestion）。

不对称PCR法是用不等量的一对引物进行PCR扩增，在最初的循环中扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当低浓度引物消耗完后，只有高浓度引物存在的PCR扩增就会产生大量的单链DNA。不对称PCR法的主要缺陷是扩增产物必须使用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶进行纯化，以便去除在不对称PCR扩增过程中产生的双链DNA及其它副产品。但聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶纯化会导致大量ssDNA丢失，很难保证目标ssDNA的产量。

生物素-链霉亲和素分离法是使用生物素标记其中一条引物进行PCR扩增。扩增结束后，在产物中加入链霉亲和素磁珠，携有生物素的dsDNA与携有链霉亲和素的磁珠结合，将dsDNA从扩增产生物中分离出来。然后使用碱法或加热法对结合于磁珠上的dsDNA进行处理，使之释放出无生物素标记的ssDNA。该法的主要缺陷是ssDNA是通过碱或热处理获得的，不仅产量低而且在处理过程中会导致ssDNA失去原有的三维结构，对Aptamer筛选的特异性与亲和性产生较大影响。

核酸外切酶消化法是在PCR扩增产物中加入λ核酸外切酶（Lambda exonuclease）对dsDNA进行消化来获得ssDNA。为获得能满足下轮筛选所需的ssDNA次级文库，经消化后的扩增产物同样需聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶纯化，去除未消化的dsDNA、消化后的碎片、核酸酶等，通过该法所获得的ssDNA产量极低。

可见，目前常用的ssDNA次级文库制备方法存在着产量低或特异性差的缺陷。

发明内容

本发明提供了一种高纯度、高产量的ssDNA次级文库的制备方法，此制备方法同时保证了ssDNA的亲和性与特异性。

本发明提供了一种制备ssDNA次级文库的方法,包括如下步骤：

步骤一：使用均有生物素标记的上、下游引物对ssDNA文库进行PCR扩增，获得携有生物素的dsDNA；

步骤二：以步骤一得到的携有生物素的dsDNA扩增产物为模板，使用无生物素标记的上游引物，以及生物素标记的下游引物，进行不对称PCR扩增得到混合扩增产物；

步骤三：在步骤二的混合扩增产物中加入链霉亲和素磁珠，去除扩增产物中所有携带生物素的dsDNA和副产品，从而获得ssDNA次级文库。

所述步骤一中，ssDNA文库由82bp组成：5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N40-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’。其中N40为40bp的随机序列。

所述步骤一中，生物素标记上游引物为5’-biotin-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’，所述生物标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’，其中biotin 为生物素。

所述步骤一中，PCR反应体系如下所示：

10×Buffer 5μl

MgCl₂（25mM）3μl

dNTP（10mM） 2μl

Taq酶（5U/μl） 0.5μl

生物素标记上游引物（10pmol/μl）5μl

生物素标记下游引物（10pmol/μl）5μl