[发明专利]ssDNA次级文库的制备方法

权利要求书

1.一种ssDNA次级文库的制备方法,包括如下步骤：

步骤一：使用均有生物素标记的上、下游引物对ssDNA文库进行PCR扩增，获得携有生物素的dsDNA；

步骤二：以步骤一得到的携有生物素的dsDNA扩增产物为模板，使用无生物素标记的上游引物，以及生物素标记的下游引物，进行不对称PCR扩增得到混合扩增产物；

步骤三：在步骤二的混合扩增产物中加入链霉亲和素磁珠，去除扩增产物中所有携带生物素的dsDNA和副产品，从而获得ssDNA次级文库；

所述步骤一中，PCR反应体系如下所示：

10×Buffer 5μl

MgCl₂ 25mM 3μl

dNTP 10mM2μl

Taq酶 5U/μl0.5μl

生物素标记上游引物 10pmol/μl 5μl

生物素标记下游引物 10pmol/μl 5μl

ssDNA文库 50ng/μl1μl

ddH₂O28.5μl

总体积 50μl

所述Taq酶选自Promega公司的型号为M1665S的试剂盒；

所述步骤一中，PCR扩增条件如下所示：

第一阶段：

94℃5min

第二阶段：11个循环

94℃30s

59℃30s

72℃30s

第三阶段：

72℃5min

4℃保存；

所述步骤二中，PCR反应体系如下所示：

上游引物 10pmol/μl 2μl

生物素标记下游引物 0.5pmol/μl2μl

dsDNA扩增产物1μl

AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix 2×10μl

ddH₂O5μl

总体积 20μl

所述AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix 2× 来自Life Technologies公司的4390939试剂盒；

所述步骤二中，PCR扩增条件如下所示：

第一阶段：

95℃ 10min

第二阶段：30个循环

96℃3s

59℃3s

68℃3s

第三阶段：

72℃10s

4℃保存。

2.根据权利要求1所述的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，ssDNA文库由82bp组成：5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N40-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’；其中N40为40bp的随机序列。

3.根据权利要求2所述的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，生物素标记上游引物为5’-biotin-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’，所述生物标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’，其中biotin 为生物素。

4.根据权利要求1所述的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述上游引物为5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’，所述生物素标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’，其中biotin 为生物素。

5.根据权利要求4所述的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述无生物素标记的上游引物和生物素标记的下游引物的物质的量之比为10:1～30:1。

6.根据权利要求1所述的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，所述步骤三得到的ssDNA次级文库的浓度为810～1230nM。