[发明专利]脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途。

背景技术

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。目前脂肪干细胞主要运用于脂肪组织移植中的丰胸、除皱等美容行业，其在促进移植后脂肪细胞的存活率有很大的提高。另脂肪干细胞经体外大规模培养后，激活干细胞功能，促进分泌VEGF、BFGF、IGF等细胞因子.

衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，它是复杂的自然现象，表现为结构和机能衰退，适应性和抵抗力减退。实质是身体各部分器官系统的功能逐渐衰退的过程。

在正常生理过程中，人体每天都有大量细胞死亡，同时伴有大量细胞的新生，以维持各种组织和器官的完整性，保证功能处于正常状态，而发挥细胞新生功能的是体内的各种干细胞。随着年龄的增长，当体内的干细胞量减少，使细胞的死亡与新生失去平衡，干细胞无法满足机体对新生细胞的需求，就会导致组织器官功能的减退、疾病发生，甚至死亡。所以及时补充体内干细胞量或激活、修复体内衰老细胞以维持体内细胞死亡与新生的平衡是抗衰老的重要途径。

目前主要采用移植植物和蛋白诱导性造血干细胞来达到抗衰老的目的。但存在如下缺点：1、诱导得到的主要是造血干细胞，在功能上局限于血液系统；2、培养得到的造血干细胞纯度在5-40％，纯度过低。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途，获得的脂肪间充质干细胞制剂，脂肪间充质干细胞纯度高达90％以上，能更好的发挥干细胞的功能，达到抗衰老目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；

步骤2：培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA-胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤1中所述预处理为加PBS洗涤、离心。

优选的，离心的条件为1500rpm离心5min。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤1中所述酶解为采用0.5％Ⅰ型胶原酶，37℃、100R消化50min；所述Ⅰ型胶原酶与所述脂肪的体积比为0.5～1:1。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤2所述培养采用完全培养基调整细胞密度为1×10⁵cell/mL，添加1μg/mL EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下培养；所述完全培养基包括DMEM/F12和10％FBS。

作为优选，步骤2所述培养48h后用10mL PBS清洗，重复2次，取10mL的细胞悬液添加100uL的1ug/mL EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下继续培养；所述脂肪间充质干细胞的悬液与所述EGF的体积比为10:0.1。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法EDTA-胰酶溶液中EDTA-胰酶的浓度为0.25w/v％，所述脂肪间充质干细胞贴壁面积与EDTA-胰酶溶液的比例为：每10cm²的面积添加0.5～1ml EDTA-胰酶溶液，所述消化的时间为1～2min。

作为优选，步骤2所述终止消化具体为加FBS终止消化，FBS与所述脂肪间充质干细胞的悬液的体积比为1:10。

作为优选，步骤2所述离心为1500rpm/min离心5min。

在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法中所述传代培养具体为加入完全培养基和EGF，于5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的条件下培养；所述完全培养基包括DMEM/F12和10％FBS；所述细胞传代培养密度为1×10⁵cell/mL。。

本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：