[发明专利]用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法。

背景技术

镰刀菌属(Fusarium)属于半知菌类(Imperfecti fungi)、从梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)，该属分为蛛丝组、马特组、色变组和美丽组等多个组，各个组内又可分为不同的种，如蛛丝组中包含有焦斑镰刀菌、烟草镰刀菌、单隔镰刀菌和雪腐镰刀菌。镰刀菌属的各个种广泛分布于土壤和有机体中，一些镰刀菌，如尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌等或可以寄生于生物体，直接造成人类、动物、植物疾病；或产生有毒物质，污染人们和动物的食物。因此，开展不同镰刀菌分类鉴定研究具有十分重要的意义。另外，由于镰刀菌具有高度的适应性和变异性，容易随环境条件的变化而变异，有些镰刀菌种间差异很小，因而，给镰刀菌种类鉴定工作造成一定的困难。

目前，对镰刀菌分类除了采用分子系统学，如主要基因位点β-tubulin、mtSSU rDNA、28S rDNA、ITS、EF-1α、IGS等作为辅助分类外，更多的还是采用镰刀菌属种的传统分类鉴定：1）用PDA培养基培养，观察其培养性状, 如颜色、气味、生长速度、气生菌丝等；2）用SNA 或CLA 培养基培养观察其显微特征，如大、小型分生孢子的产生情况及其形态，厚垣孢子的有无和产生方式(假头状/假链状)，产孢细胞的类型(简单瓶梗或多出瓶梗)，粘孢团、菌核的产生情况等。因此，产孢细胞及其大、小型分生孢子产生方式的特征准确定性，是鉴定工作的重要一环，目前，人们常用的镰刀菌产孢细胞及其大、小型分生孢子产生方式的显微分析方法有：

1.插片法，其步骤是：（1）制备培养平板：将固体培养基（PDA或水琼脂）倒入无菌的培养皿中，厚度约0.3～0.5 cm，待培养平板凝固后进行后续试验；（2）接种：取出-80℃（或4℃）保存的菌株并接种于培养平板中央；（3）插片：用无菌镊子将无菌的盖玻片以 45 度角斜插于培养基中，插片位置与接种块距离为1.0～1.5cm；（4）培养：处理后的接种平板倒置，放于22～25℃适宜镰刀菌生长的环境中培养，待菌丝铺展开来，长过插片的位置后，即可取出玻片进行后续试验；（5）制片：打开培养皿盖，用镊子将生长有菌丝的玻片取出，除去玻片背面的菌丝及培养基，另取一个干净的载玻片，载玻片上滴一滴染料或蒸馏水，将玻片正扣在载玻片上，此时，菌丝在载玻片与盖玻片之间，避免制片过程中产生气泡；（6）封片：用甘油、树脂或指甲油等在上面做好的玻片四周涂抹封片；（7）观察：显微镜观察。

2.水琼脂凹槽接种法，其步骤如下：（1）在水琼脂培养平板上挖取一个凹槽，移除凹槽内的培养基；（2）将一块尺寸小于凹槽的水琼脂培养基块放置在凹槽内；（3）挑取待鉴定真菌培养物接种于位于凹槽内的水琼脂培养基块朝上的一面，然后将无菌盖玻片盖于水琼脂培养基块上；（4）盖上培养皿盖，密封后于22～25℃下培养；（5）培养结束后取出盖玻片，制作成真菌的观察玻片。可以根据不同菌种的生长周期，采用连续取片的方式，获得不同发育时期菌体观察玻片。

3.挖沟边沿接种法，步骤如下：（1）制备培养平板：将固体培养基（PDA或水琼脂）倒入无菌的培养皿中，厚度约0.3～0.5 cm，待培养平板凝固后进行后续试验；（2）在（1）制备培养平板上用无菌刀挖沟，除去沟内固体培养基，一般直径为9cm的培养皿挖两条沟，放上四个盖玻片；（3）接种培养，在沟的内侧涂抹制备的分生孢子悬浮液，盖上盖玻片，放于22～25℃培养；（4）根据实验设计，取出不同时期培养玻片进行观察，拍照。

4.菌块培养法，其步骤如下：（1）取直径7cm左右的圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部；（2）滤纸上放一个U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖，进行灭菌，或者将物品分别灭菌，再按次序组装；（3）从事先准备好的平板中切一块边长1cm左右的正方形培养基，放在载玻片中央；（4）在培养基的四个侧面接种，然后用镊子夹起盖玻片盖在培养基上，轻轻压一下；（5）在滤纸上滴加无菌水或10%甘油3～4mL，盖上平皿盖，22～25℃下保湿培养；（6）培养结束后，直接取盖玻片制片观察。

5.挑取菌丝法，其步骤如下：（1）取出一片干净载玻片，滴一滴乳酸棉兰染色剂；（2）用接种针从接种10d的PDA培养平板上挑取少量菌丝（含有孢子）；（3）适当处理使菌丝均匀分散于染色液当中，盖上盖玻片并除去气泡；（4）制片2min后，即可用于显微镜观察。