[发明专利]用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法

权利要求书

1.一种用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分生孢子获得：取-80℃或4℃条件下保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板培养基上，25℃条件下培养7～10d；

（2）分生孢子悬浮液的制备：

① 向接种培养了7～10d的PDA平板培养基中加入15～25mL无菌水，用无菌涂布器轻轻涂布菌落表面，使分生孢子充分释放于水中，获得分生孢子悬浮液；

② 取2～4层无菌擦镜纸过滤步骤①中所得分生孢子悬浮液，去除菌丝或菌块，镜检其浓度后，调配成浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液；

（3）制备SNA观察平板：将制备好的、50～55℃的SNA培养基轻轻倒入一次性无菌培养皿中，制备厚度为1～1.2mm的SNA观察平板，待观察平板凝固后备用；

（4）接种培养：取10µL浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液与150 µL无菌水均匀混合后，均匀涂布于步骤（3）制备的SNA观察平板上，盖上培养皿盖并封口保湿，于25℃培养24～48h备用；

（5）制备观察玻片：根据镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生发育进程，设定不同时间分析点，用无菌切割刀切取厚度为1～1.2mm，大小为5～12mm×5～12mm的SNA观察培养菌块，倒扣于大小为40mm×18 mm的盖玻片上，轻轻挤压，赶出盖玻片与培养物之间的气泡；

（6）显微观察：采用倒置显微镜观察镰刀菌在个体发育进程中不同时期的产孢细胞形态特征及其分生孢子的产生方式。

2.根据权利要求1所述的显微分析方法，其特征在于，所述PDA平板培养基的制备方法如下：取马铃薯400g加水煮沸10min的滤液、葡萄糖20g、琼脂粉15g，加蒸馏水至1000mL，调节pH至7.0，于121℃下灭菌15min。

3. 根据权利要求1所述的显微分析方法，其特征在于，所述SNA培养基的制备原料如下：蒸馏水 1L、KH₂PO₄ 1g、KNO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、葡萄糖 0.2 g、蔗糖 0.2g、1mol/L的NaOH 0.6mL、琼脂粉15 g，调节pH至6.5～7.0，于121℃下灭菌15min。