[发明专利]一种朗德鹅三种致病菌的快速检测试剂盒及其检查方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种朗德鹅三种致病菌的快速检测试剂盒及其检查方法，属于家禽病害防治领域。

背景技术

朗德鹅原产于法国西南部的朗德地区，体型中等，羽毛灰褐色，颈部接近黑色，腹部毛色呈银灰色。郎德鹅生长速度快，8周龄体重可达4.5～5kg，作为商品鹅出售，成年体重7～8kg，羽绒产量较高。耐人工拔羽，通常种鹅每年拔羽两次。可产羽绒350～450g；肝用性能好，是世界上最适于生产鹅肥肝的鹅种。其肉质细嫩，瘦肉率高，胆固醇含量低，富含多种氨基酸，具有野禽肉的味道。耐粗饲，适应性强，成活率高，是进行养殖的理想品种。

大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌是目前引起朗德鹅发病的三种常见重要致病菌。当前,对这些致病菌的检验我们大多仍沿用传统的细菌培养、血清学及生化鉴定等方法,检测周期长、操作繁琐、灵敏度低,而且每次只能检测出一种致病菌，而很多时候会出现混合感染，目前的实验室检测方法明显滞后。

因此,建立快速敏感和特异的分子生物学检测方法对于尽快明确致病因素和采取有效的预防和治疗措施都是非常必要的。

发明内容

本发明提供了一种朗德鹅三种致病菌的快速检测试剂盒及其检查方法，解决了现有检测方法检测周期长、操作繁琐、灵敏度低,而且每次只能检测出一种致病菌等问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种朗德鹅三种致病菌的快速检测试剂盒及其检查方法，包括以下成分：EX-Taq酶、10×EX-Taq buffer、dNTP mixture、ddH₂O和三对特异性引物，其中第一对引物是：

P1:5'TCG CTG GCG GTG TTG AGT AC 3'；

P2:5'TCC AGA GCA GCC TGA CCT TC 3'；

第二对引物是：

P3:5'AAA AGA AGG GTC GTC GTT AG 3'；

P4:5'GGA AGG TAC TGC CAG AGG TC 3'；

第三对引物是：

P5:5'GCA GGAGGA ACA GGA GGG TG 3'；

P6:5'TCT TCG GCG TTA GCA ATC AT 3'。

本发明也提供了一种朗德鹅三种致病菌的的方法，利用本发明的试剂盒，包括以下步骤：

(1)临床样品检测：将临床采集保存的朗德鹅疑似病例其肝、脾组织，研磨后用灭菌生理盐水1：5的重量比例稀释，稀释病料中加入增菌培养基500μl，使病料在培养基中的比例为20％，37℃摇振培养2～4h，将培养物10000r/min离心，去除上清，剩余培养物吹打均匀，99℃水浴10～15min，作为DNA模板，进行多重PCR检测；

(2)多重PCR体系的建立：采用50μL反应体系,其中EX-Taq酶0.25μL,10×EX-Taq buffer 5μL，dNTP mixture 4μL,P1、P2、P3、P4、P5、P6各0.2μL,DNA模板2μL，加ddH₂O至50μL，

PCR扩增程序:94℃，5min；94℃，20s；50-58℃，50s；72℃，40s；30个循环；

72℃延伸5min，50～58℃退火，PCR产物在进行1％琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪扫描成像；

(3)结果判断：如果电泳结果出现大小约266bp的条带，则判定出现大肠杆菌感染,如果电泳结果出现大小约445bp的条带，则判定出现多杀性巴氏杆菌感染，如果电泳结果出现大小约801bp的条带，则判定出现沙门氏菌感染。

进一步，本发明的一种优选方案：退火温度为55℃。选择50～58℃退火的退火温度，三条引物均能比较清晰的条带,但当温度再提高时扩增出的片段会出现拖尾现象。尤其是选择55℃为三重PCR方法的退火温度，条带最清楚。

本发明的试剂盒对三种菌的检测下限为10⁵CFU/mL。

本发明的有益效果：

本发明的试剂盒：多重PCR的阳性检出率高于传统方法，大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌三重PCR快速检测技术，具有操作简单、检测时间短、特异性和灵敏度高等优点,能在较少时间内同时快速检测病料中可能的3种致病菌。

本发明的试剂盒采用的3对引物对检测的所有的大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌均为阳性，但对其他所测的金黄色葡萄球菌、鸭疫里氏杆菌、溶血性链球菌、绿脓杆菌、枯草芽胞杆菌等细菌均为阴性，引物特异性良好。