[发明专利]一种朗德鹅三种致病菌的快速检测试剂盒及其检查方法

权利要求书

1.一种朗德鹅大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌三重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：包括以下成分：包括EX-Taq酶、10×EX-Taq buffer、dNTP mixture、ddH₂O和三对特异性引物，其中第一对引物是：

P1:5'TCG CTG GCG GTG TTG AGT AC 3'；

P2:5'TCC AGA GCA GCC TGA CCT TC 3'；

第二对引物是：

P3:5'AAA AGA AGG GTC GTC GTT AG 3'；

P4:5'GGA AGG TAC TGC CAG AGG TC 3'；

第三对引物是：

P5:5'GCA GGAGGA ACA GGA GGG TG 3'；

P6:5'TCT TCG GCG TTA GCA ATC AT 3'。

2.一种朗德鹅大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌三重PCR快速检测的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)临床样品检测：将临床采集保存的朗德鹅疑似病例其肝、脾组织，研磨后用灭菌生理盐水1：5的重量比例稀释，稀释病料中加入增菌培养基500μl，使病料在培养基中的比例为20％，37℃摇振培养2～4h，将培养物10000r/min离心，去除上清，剩余培养物吹打均匀，99℃水浴10～15min，作为DNA模板，进行多重PCR检测；

(2)多重PCR体系的建立：采用50μL反应体系,其中EX-Taq酶0.25μL,10×EX-Taq buffer 5μL，dNTP mixture 4μL,P1、P2、P3、P4、P5、P6各0.2μL,DNA模板2μL，加ddH₂O至50μL，

PCR扩增程序:94℃，5min；94℃，20s；55℃，40s；72℃，50s；30个循环；

72℃延伸5min，50～58℃退火，PCR产物在进行1％琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪扫描成像；

(3)结果判断：如果电泳结果出现大小约266bp的条带，则判定出现大肠杆菌感染,如果电泳结果出现大小约445bp的条带，则判定出现多杀性巴氏杆菌感染，如果电泳结果出现大小约801bp的条带，则判定出现沙门氏菌感染。

3.根据权利要求2所述的一种朗德鹅大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌三重PCR快速检测的方法，其特征在于：退火温度为55℃。