[发明专利]还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种

说明书

技术领域

本发明涉及一种产羧基还原酶的菌种及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

利用酶或者微生物作为催化剂，可高度立体、位点和区域选择性的将化学合成的外消旋衍生物转化成手性产物，此方法具有反应条件温和、位点选择性强、副反应少、产物较单一、收率高、光学纯度高、无环境污染等特点。以酶作为生物催化剂，催化拆分反应制备光学活性化合物已经成为普遍采用的一种方法。

羰基还原酶(EC1.1.1.184)在酶学分类上属于短链脱氢/还原酶类，以NADPH为辅酶，催化还原许多在生理和药理上有活性的羰基化合物，并且大多数都为单亚基的胞内酶。

羰基还原酶是重要的生物催化剂，能将混旋底物转化成具有手性的重要医药中间体，因此在不对称合成的有机反应中起着重要的作用。许多手性醇可以通过羰基还原酶对潜手性酮的立体选择性还原得到。到目前为止，已分别报道了在Saccharomyces cerevisiae，Candida magnoliae，Candida parapsilosis，Rhodococcus erythropolis等不同的微生物中分离得到了具有立体选择性的羰基还原酶，有的甚至已对其编码基因在不同的宿主中达到了高表达，并应用于生物催化领域。

发明内容

本发明提供一种能高立体选择性地催化还原反应的产羧基还原酶的菌种，以及一种利用该羧基还原酶催化5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原生成顺式3,5-二羟基己酸酯化合物。

本发明的技术解决方案是：

一种产羧基还原酶的菌种，所述菌种为Rhodococcus sp.SG-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO:M2014636，保藏时间2014年12月7日。

优选地，所述的一种产羧基还原酶的菌种在5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原以制备顺式3,5-二羟基己酸酯化合物中的应用。

优选地，一种产羧基还原酶的菌种在5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原以制备顺式3,5-二羟基己酸酯化合物中的应用，所述应用包括如下步骤：

以5-羟基-3-氧代己酸酯对映体为底物，以产羧基还原酶的菌种在培养基中经培养获得的羧基还原酶为催化剂，在PH=5-8、浓度为0.01-1.0mol/L的缓冲液中进行5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原，反应结束后经有效转化得到顺式3.5-二羟基己酸酯，所述反应条件控制在20-35℃，维持PH=7，反应时间控制在48-96小时之间。

优选地，所述的一种产羧基还原酶的菌种在5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原以制备顺式3.5-二羟基己酸酯化合物中的应用，所述缓冲液的PH=6.5-7.5，浓度为0.05-0.2mol/L，反应条件控制在25℃，反应时间为72小时。

优选地，所述缓冲液为三乙醇胺（氯化物）缓冲液、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液、磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液）。0.1mol/L的三乙醇胺溶液，其pH值为7.0.配制方法如下：8.75g三乙醇胺纯液加入400ml水以及1.85g EDTA，盐酸调节pH 7.0后，水定容至500ml。

上述为500ml 0.1mol/L（pH7） 三乙醇胺配制方法，其他体积的配制按比例缩放即可。

优选地，所述缓冲液中还添加有还原性二型辅酶。

优选地，所述产羧基还原酶的菌种在培养基中，在30℃，200r/min，培养24h，将得到的培养物按5%的体积比转接到相同组分的新鲜培养基中继续培养12小时，经多次传代培养，并经过0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤2次，获得含羧基还原酶菌体的细胞，所述培养基PH调节范围为6.5-7.5之间，优选为PH为7，培养基终浓度组成如下：

其中，基本营养物质，其含量浮动范围能承受正负20%，而微量元素浮动范围则在5%之内。

该菌株的形态：好气、革兰氏阳性、多形态菌，可能形成雏形菌丝体，立即断裂为不规则细胞，不游动，可能部分抗酸，无气丝(有时有少量气丝)。

菌落特征：菌落粗糙或光滑、甚至粘液状，与分枝杆菌类似。一般呈浅橙黄色、粉色、橙色或红色，有无色变异型。

细胞形态：细胞壁Ⅳ型。

生理生化特性：DNA内G+C含量为61—68%。

本发明使用5-羟基-3-氧代己酸酯顺式对映体作为筛选培养基中的唯一碳源对采集的各种不同来源的土壤样本进行大量、广泛的筛选。