[发明专利]一种人脐带间充质干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞的培养方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要作用。

目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。脐带间充质干细胞(UCMSCs)是存在于脐带华尔通胶(Wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。

目前脐带间充质肝细胞的原代分离的方法主要有酶解法及组织块培养法。酶解法中使用到的胶原酶等来源可能涉及动物来源，且价格昂贵，对细胞损伤较大。而组织块培养法细胞爬出的时间较长，原代培养时间过长使得细胞容易长老，细胞纯度不够，容易受到脐带中其他细胞的污染。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，本发明所述培养方法原代培养时间短、简单经济，可获得大量高纯度脐带间充质干细胞，且能保持脐带间充质干细胞良好的干细胞特性。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后加入完全培养基，于37℃，5％CO₂静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。

本发明脐带间充质干细胞的培养方法，所述脐带可以取自产后弃置的脐带组织，采用含有双抗的PBS保存。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉素工作浓度为0.1mg/mL。

本发明脐带间充质干细胞的培养方法中所述脐带预先清洗表面血迹并消毒。在一些实施方案中，所述脐带用50mL～150mL无菌的PBS清洗脐带表面血迹，用50mL～150mL75％乙醇消毒脐带表面，再用50mL～150mL PBS清洗数遍尽量去除血迹。

本发明脐带间充质干细胞的培养方法，脐带去除最外层膜及静脉跟动脉后剪碎以充分与培养基接触。在一些实施方案中，脐带去除最外层膜及静脉跟动脉后剪至大小为1mm³～3mm³的小块，以0.5cm～1cm的间隔把组织块分布于培养皿中。

在一些实施方案中，所述培养方法将将间隔放置的组织块静止风干20min～60min。

本发明脐带间充质干细胞的培养方法，将剪碎的组织块加入完全培养基培养进行原代细胞分离。其中，所述完全培养基配方为lonzaUltraCULTURE MEDIUM无血清培养基+10v/v％PALL血清替代物+1v/v％200mM/L-谷氨酰胺+1×NEAA、5ng/mL～50ng/mL EGF。

在一些实施方案中，所述培养前完全培养基的加入量为0.07mL/cm²-0.1mL/cm²。

本发明脐带间充质干细胞的培养方法，在培养期间需要补加完全培养基直至组织块有细胞爬出。在一些实施方案中，所述培养期间补加完全培养基的加入量为0.07mL/cm²-0.1mL/cm²。

本发明脐带间充质干细胞的培养方法，在组织块有细胞爬出后去掉组织块，并对细胞进行清洗。所述清洗可以采用PBS清洗。

本发明脐带间充质干细胞的培养方法，在清洗后加入完全培养基培养细胞至集落成片进行传代。在一些实施方案中，所述清洗后完全培养基的加入量为0.15mL/cm²-0.21mL/cm²。

在一些实施方案中，所述传代培养为去掉细胞培养上清，清洗后加入含胰酶和EDTA的消化液消化，用完全培养基终止消化，离心，弃上清，用完全培养基重悬后，传代。