[发明专利]乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因序列如SEQ ID No.2所示；该融合蛋白携带有三种乙肝病毒抗原的四个超型表位，分别为HBsAg281‑290、HBcAg98‑107、Pol321‑330和Pol661‑670，还携带有Th表位Padre和志贺毒素，融合蛋白可用于制备乙肝治疗性疫苗，具有靶向性强、适应人群广等优点。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种融合蛋白，还涉及该融合蛋白的制备方法，以及在制药领域中的应用。

背景技术

乙肝病毒(HBV)是重要的肝脏疾病致病因子。慢性HBV感染患者主要表现为肝损伤以及与脂肪变性和纤维化相关的代谢紊乱，长期感染患者有可能发展为肝硬化和肝癌。目前治疗慢性HBV感染主要采用以抗病毒药物和细胞因子为主、中医药为辅的治疗方法，虽然取得了一定疗效，但存在不能有效清除HBV、复发率高等缺点。因此，研究慢性HBV感染的新型治疗方法和治疗药物是我国当前亟待解决的重大课题之一。

随着乙肝病毒学和现代免疫学的快速发展，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在HBV清除过程中的关键作用得到深刻认识。利用CTL抑制HBV的复制并进一步将其清除，已成为极富前景的慢性HBV感染治疗方法。现有文献已报道了一些以激发特异性CTL反应为目标的乙肝疫苗，包括多肽疫苗、蛋白疫苗和DNA疫苗等。但这些疫苗并不完善，例如多肽疫苗多数是由单一抗原单一MHC限制性的单一表位或多表位串联而成，存在表位单一、宿主限制性、免疫原性差等缺点；蛋白疫苗可以多次免疫，但由于单一蛋白抗原表位的免疫原性差，在体内不能有效激发特异性CTL反应；DNA疫苗虽然在体内可以有效激发特异性CTL反应，但由于质粒DNA的转染具有非特异性，对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原耐受，存在多次免疫效果差的问题，难以适应慢性HBV感染患者长期治疗、多次免疫的要求。因此，迫切需要开发一种适应广泛人群MHC限制性的更高效的乙肝疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种融合蛋白，免疫原性和靶向性强，能够激发特异性CTL反应，高效抑制和清除乙肝病毒，同时能够适应广泛人群MHC限制性，可用于制备高效乙肝疫苗。

为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.含有上述编码基因的重组表达载体。

4.含有上述重组表达载体的转化菌。

5.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因克隆入质粒pET300中，获得重组表达载体pET300-STXB-EP；将重组表达载体pET300-STXB-EP转化大肠杆菌BL21(DE3)，用终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于温度37℃诱导表达4小时，收集菌体，超声破碎，离心取上清，用Ni²⁺亲和层析柱纯化，用TEV蛋白酶酶切去除His标签，再过葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，即得乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白。

6.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白在制备乙肝治疗性疫苗中的应用。