[发明专利]嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，尤其涉及一种嵌合抗原受体CD3⁺/CD4^－/CD8^－双阴性T细胞的构建方法。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CAR－T细胞)技术，是利用基因工程和病毒转染技术给杀伤性T细胞构建一个外源性的嵌合抗原受体，使其可以特异性识别肿瘤标志物，并促进CAR－T细胞增殖、活化，持续性发挥肿瘤杀伤功能的技术。由于其对CD19⁺急性B淋巴细胞白血病的卓越的临床试验结果，已经引起医学界的广泛关注，被认为是最有希望治愈肿瘤的疗法。

然而，当前的CAR－T临床试验都是从患者自体内分离出T细胞进行CAR－T细胞的制备，这就对患者的T细胞质量提出了很高的要求，临床应用上对患者的T细胞占PBMC的比例、T细胞增殖和激活能力，以及T细胞的杀伤功能等均有较高的适用性标准。临床试验实践中发现，超过80％的患者的T细胞达不到CAR－T细胞制备的要求，因此大多数患者无法从现行的CAR－T治疗中受益。鉴于这一问题，同源异体类CAR－T的制备成为研究的热点。

目前的一个研究方向是通过基因敲除技术将同源异体来源的T细胞的T细胞受体(TCR)敲除(TCR－KO)后，使其失去MHC限制的特性，然后纯化出TCR敲除的T细胞，再进行CAR－T细胞的制备，使之发挥肿瘤杀伤作用而避免引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。但在实际应用中遇到很大的技术瓶颈，主要原因是用于基因敲除技术的CRISPR－Cas9等载体分子量较大，导入T细胞困难、其基因敲除的效率低下。并且，如果使用病毒转染的方式导入CRISPR－Cas9等载体，又会出现嵌合抗原受体二次病毒转染的抵制现象，因此TCR－KO－CAR－T细胞得率极低，不能进行大规模制备，应用性差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，利用CD3⁺/CD4^－/CD8^－双阴性T(DN T)细胞的抗肿瘤特性和主要组织相容性抗原(MHC)的非限制性，结合已有的嵌合抗原受体技术，构建出一种新型的嵌合抗原受体双阴性T细胞(CAR－DN－T)。DN－T细胞可从正常人外周血中分离纯化，利用我们创建的独特激活和病毒转染方式，可高效地使其转染上特定的嵌合抗原受体，特异性杀伤嵌合抗原受体识别的肿瘤细胞。实验数据显示制备的CAR－DN－T细胞不具有MHC限制性，不会引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，可以回输到其他适应症患者体内进行同源异体式的嵌合抗原受体T细胞(CAR－T细胞)临床治疗，是一种新型的CAR－T细胞，可以快速进行推广和产业化。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，根据CD3⁺/CD4^－/CD8^－双阴性T细胞的特性，体外分选出纯化的CD3⁺/CD4^－/CD8^－双阴性T细胞，利用多种细胞因子信号通路和TCR信号通路协同作用的原理，筛选出适合于双阴性T细胞激活和病毒转染的体外培养方案，能够快速、可控的激活双阴性T细胞，并将特定的嵌合抗原受体用慢病毒转染技术高效率表达于双阴性T细胞上，制备出CAR－DN－T细胞，使其能特异性的识别嵌合抗原受体对应的肿瘤细胞，促进CAR－DN－T细胞的进一步活化和增殖，并快速杀伤肿瘤细胞。

进一步的，所述体外分选方案为，利用CD4/CD8生物素标记抗体阴性分选和CD3/CD28磁珠标记抗体阳性分选联合使用，分选出高纯度的CD3⁺/CD4^－/CD8^－双阴性T细胞，然后对纯化的双阴性T细胞加入特定配比混合的细胞因子混合液刺激，培养72小时后进行嵌合抗原受体病毒转染，得到高比例的CAR－DN T细胞。

优选的，所述细胞因子混合液包括：IL－2、IL－15、GMCSF、TNFα、IFNγ。

本发明的有益效果是：