[发明专利]一种产N-乙酰神经氨酸重组微生物的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及产N-乙酰神经氨酸的重组微生物及其构建方法与应用。早在1927年，美国的Landsteiner等人就发现特定的动物脂质制各物中含有类似糖的组分，它可以与Bial’s试剂反应呈紫色。之后，Klenk等人用温和的方法分别裂解脑糖脂和颌下腺粘蛋白，从中分离出与Bial’s试剂反应呈紫色的物质，将其命名为唾液酸(Sialic acid)。迄今为至，已发现唾液酸家族的成员有四十余种，其中最为重要的是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，它的含量占整个唾液酸家族的99％以上，人们对它的研究也更为深入。一般所说唾液酸的商业化生产即为Neu5Ac的工业规模制备，主要包括：从天然材料提取、化学合成、酶法合成以及微生物发酵等方法。

唾液酸以糖复合物的形式广泛存在于动物细胞表面，但含量相当低。自从发现唾液酸以来，人们已分别从燕窝、牛奶、禽蛋等天然原料中提取得到唾液酸。Masskam Shimatanl从酪蛋白中提取唾液酸(Masskma Shrinatnaletal.United States Patent,5270462,Dee.14,1993)。Martin等从燕窝中提取到了唾液酸(Martin JE,Tanenbaum SW.Carbohydrate Research,1976.423-425)。2003年，Koketsu对乌骨鸡鸡蛋中唾液酸的含量进行了研究，在温和酸性条件下加热至70℃-90℃发现从单个鸡蛋中提取的唾液酸含量约为218mg(Koketsu M.British Poultry Science,2003,44:145-148)。但唾液酸在天然原料中含量极低，分离纯化过程比较复杂且收率低，因而难于满足工业化生产的需要。

化学法合成唾液酸反应条件苛刻，需要铟等贵重金属作为催化剂，反应步骤繁多。例如在酸性醇溶液中，α-溴甲基丙稀酸在铟的催化作用下对N-乙酰甘露糖胺进行丙烯基化反应，再对得到的产物进行臭氧化反应即可得到N-乙酰神经氨酸(Chan T H,Lee M C.Journal of Organic Chemistry,1995,60:4228-4232)。但是，化学合成法涉及到复杂的基团保护和去保护步骤以及环境保护等问题，特别是产率偏低，故在应用过程受到限制。

N-乙酰神经氨酸的酶法合成主要以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，在N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase)的催化下生成N-乙酰神经氨酸。为了克服N-乙酰甘露糖胺价格昂贵的问题，人们通过碱性条件或使用N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶(GlcNAc 2-epimerase)使廉价的N-乙酰葡萄糖胺转化为N-乙酰甘露糖胺。

近几年来，研究人员将重组表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的两种大肠杆菌细胞作为生物催化介质，转化GlcNAc生产Neu5Ac(Isafomi Maru,Jua Ohnishi,Y.Journalof Bioscience and Bioscience,2002,93(3):258-265)。这种方法不用分离纯化酶，同时由 于细胞膜的保护，酶相对更稳定，辅助因子容易再生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组微生物催化生产N-乙酰神经氨酸的方法，所述重组菌为是克隆E.coliK12基因组中N-乙酰神经氨酸醛缩酶nanA基因和来源于集胞藻(Synechocystis sp.)的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶slr975基因并经过密码子优化后构建而成的重组E.coli。

所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803，核苷酸序列如GeneBank登陆序列号：NC_000911.1所示；所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因来源于E.coli K12，核苷酸序列如GeneBank登陆序列号：NC_000913.3所示；

将N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA和密码子优化后的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因slr975分别连接到载体pET-28a(+)上。